Sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic từ ruột một số loài cá da trơn có tiềm năng sử dụng làm probiotic

- SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC TỪ RUỘT MỘT SỐ LOÀI CÁ DA TRƠN CÓ TIỀM NĂNG SỬ DỤNG LÀM PROBIOTIC.
- Vi khuẩn lactic, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri, chế phẩm sinh học (probiotic), khả năng kháng khuẩn Keywords:.
- Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn tự nhiên có khả năng kháng với vi khuẩn Edwarsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh gan thận mủ (BNP) và bệnh xuất huyết trên cá tra.
- Kết quả cho thấy, 96 chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng với vi khuẩn chỉ thị Escherichia coli được chọn, với 29 chủng phân lập từ cá tra (Pangasius hypophthalmus (Sauvage, 1878.
- Kết quả nhuộm gram và kiểm tra sinh hóa cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn lactic được chọn đều là vi khuẩn gram dương, hình cầu, hình oval, que ngắn hay que dài, oxidase và catalase âm tính.
- Kết quả xác định tính đối kháng và khả năng sinh bacteriocin, thu được 46 chủng thể hiện tính đối kháng với A.
- ictaluri và 3 chủng vi khuẩn thể hiện khả năng kháng khuẩn (sinh bacteriocin), với cả 3 chủng đều kháng A.
- Sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic từ ruột một số loài cá da trơn có tiềm năng sử dụng làm probiotic.
- Tuy nhiên, trong hiện trạng thâm canh hóa mô hình nuôi cá tra như hiện nay, tình hình dịch bệnh đang diễn ra phức tạp và khó kiểm soát gây ra thiệt hại lớn cho người nuôi cá tra, trong đó, bệnh gan thận mủ (BNP) (gây ra bởi vi khuẩn E.ictaluri) và bệnh xuất huyết (tác nhân gây bệnh là A.hydrophila) là hai bệnh nguy hiểm với tần suất xuất hiện từ 60%.
- Trước tình trạng sử dụng thuốc kháng sinh không đúng cách dẫn đến nhiều tác hại nghiêm trọng như hiện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn gây bệnh, hay dư lượng thuốc kháng sinh trong vật nuôi có thể gây hại đến sức khỏe con người.
- Đặc biệt, đối với hai chủng vi khuẩn gây bệnh E.ictaluri và A.
- Trong số những giải pháp tìm được, chế phẩm sinh học được xem như một giải pháp thay thế tiềm năng vì vi khuẩn hữu ích có khả năng bám dính cao trong biểu mô ruột và còn nâng cao hệ miễn dịch của động vật.
- Trong đó, vi khuẩn lactic được chứng minh có chức năng như probiotics, có lợi với sức khỏe vật chủ khi được bổ sung đủ số lượng trong đường ruột (Nirunya B., et al., 2008), vi khuẩn lactic có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như các sản phẩm lên men, đường ruột gia súc, đường ruột các loài thủy sản,….
- Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, tế bào hình cầu hoặc hình que, catalase âm tính, không sinh bào tử.
- Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn tạo ra acid lactic, ethanol, hợp chất thơm và bacteriocin (Chen and Hoover, 2003)..
- Tuy việc sàng lọc vi khuẩn lactic từ ruột cá không còn là chủ đề mới, và những chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng làm probiotic đã được tìm thấy trước đây bao gồm Lactobacillus acidophilus, L.
- Do vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn tự nhiên có khả năng kháng với vi khuẩn E.ictaluri và A.hydrophila gây bệnh gan thận mủ (BNP) và bệnh xuất huyết trên cá tra, có tiềm năng sử dụng làm probiotics, tạo bộ sưu tập vi khuẩn cho những nghiên cứu sâu hơn về vi sinh hữu ích từ các loài cá tự nhiên hoặc cho các thí nghiệm trong điều kiện in vivo để phòng bệnh gan thận mủ và bệnh xuất huyết trên cá tra..
- 2.2 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn (Nirunya et al., 2008).
- Các loài vi khuẩn chỉ thị E.
- 1 ml vi khuẩn đã nuôi cấy được lấy chuyển sang 9 ml môi trường lỏng và ủ trong 18 giờ ở 37 0 C, mật độ vi khuẩn sau đó được điều chỉnh để đạt 10 6 CFU/ml dùng cho việc xác định hoạt động kháng khuẩn..
- 2.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn (Nirunya et al., 2008).
- 2.4 Phương pháp chọn lọc vi khuẩn có tính kháng khuẩn (Nirunya et al., 2008).
- Chọn lấy những đĩa petri có từ 50 khuẩn lạc của vi khuẩn lactic.
- Phủ lên đĩa petri đã chọn 10 ml môi trường MHB (0,75% agar) chứa vi khuẩn chỉ thị E.coli với mật độ CFU/ml và ủ trong 24h ở 37 0 C.
- Quan sát và ghi nhận kích thước vòng tròn vô trùng xuất hiện quanh khuẩn lạc vi khuẩn..
- 2.5 Phương pháp xác định tính đối kháng và khả năng sinh bacteriocin (Nirunya et al., 2008).
- lý, phần (ii) điều chỉnh pH dung di ̣ch bằng NaOH 1M để thu dung dịch có khả năng có bacteriocin thô.
- Xác đi ̣nh tı́nh đối kháng của các chủng vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn gây bệnh thông qua đường kı́nh các vòng vô trùng theo Aslim et al..
- 2.6 Phương pháp định danh vi khuẩn Hình dạng, kích thước và tính ròng của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (Barrow and Feltham, 1993).
- Sau đó các chủng có tính đối kháng mạnh với A.hydrophila và E.ictaluri và có khả năng sinh bacteriocin đối kháng được giải trình tự định danh tại công ty công nghệ sinh học Nam Khoa bằng phương pháp sinh học phân tử..
- Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 để thống kê và so sánh đường kính vòng vô trùng gây ra bởi các chủng vi khuẩn lactic.
- 3.1 Phân lập và sàng lọc vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn từ đường ruột cá da trơn.
- Kết quả phân lập từ 5 loài cá da trơn nước ngọt và xác định khả năng kháng vi khuẩn E.coli, được 96 chủng vi khuẩn lactic, trong đó có 29 chủng được phân lập từ cá tra (P.hypophthalmus), 24 chủng từ cá lăng (M.nemurus), 21 chủng từ cá vồ đém (P.larnaudii), 12 chủng từ cá trê (C.macrocephalus) và 8 chủng từ cá hú (P.larnaudii).
- Những chủng được chọn tiến hành kiểm tra đặc điểm sinh lí sinh hóa trước khi tiếp tục thực hiện thử tính đối kháng với các chủng vi khuẩn A.hydophila và E.ictaluri.
- cho thấy hầu hết chúng là những vi khuẩn gram dương, hình cầu, hình oval, hình que ngắn hay que dài, catalase và oxidase âm tính, có khả năng phân giải CaCO 3 khi phát triển trên môi trường MRS có 0,75% CaCO 3.
- Trong đó, vi khuẩn hình oval và hình que ngắn chiếm ưu thế với số chủng theo thứ tự là 43 chủng (45%) và 39 chủng (41%) (Bảng 1)..
- Hình 1: A: Khuẩn lạc vi khuẩn lactic trên đĩa thạch MRS được tráng bằng MHB 0.75% agar chứa vi khuẩn E.coli.
- B, C: Vi khuẩn lactic có khả năng làm tan vôi khi phát triển trên đĩa thạch MRS có.
- Bảng 1: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn lactic phân lập được từ ruột cá da trơn tự nhiên.
- Nguồn phân lập Hình thái tế bào vi khuẩn.
- 3.2 Tính đối kháng và khả năng sinh bacteriocin.
- hydrophila từ bộ sưu tập vi khuẩn của bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ..
- Kết quả cho thấy, trong 96 chủng vi khuẩn lactic chọn lọc được, có 46 chủng thể hiện tính đối kháng và 3 chủng có khả năng sinh bacteriocin..
- Trong đó, các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ cá tra chiếm số lượng nhiều nhất với 22 chủng, 15 chủng phân lập từ cá lăng.
- Vi khuẩn lactic phân lập từ cá vồ đém có 7 chủng, từ cá trê chỉ có 2 chủng thể hiện tính đối kháng và vi khuẩn phân lập từ cá hú không thể hiện tính đối kháng với A.hydrophila..
- Hầu hết các chủng vi khuẩn lactic đều thể hiện tính kháng trung bình (với đường kính vùng vô trùng trung bình (d) từ 4,5 mm đến 9,5mm) và yếu (d=.
- Bên cạnh đó, 3 chủng CL2, CL10.20 và CT3.7 thể hiện khả năng sinh bacteriocin trung bình và yếu với.
- Hình 2: Đường tròn vô trùng tạo ra bởi vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin đối.
- với vi khuẩn Aeromonas hydrophila.
- 1.1, 2.1: dung dịch ly tâm từ vi khuẩn lactic không xử lý.
- tâm từ vi khuẩn lactic chuẩn pH (6.5-7) bằng dung dịch NaOH 1M.
- Bảng 2: Bảng đường kính vòng vô trùng gây ra bởi hoạt động kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn chỉ kháng với Aeromonas hydrophila.
- phân lập Tên chủng Khả năng đối kháng Khả năng sinh bacteriocin Đường kính vòng vô.
- CL10.20 6.
- CL10.14 3.
- CL10.10 2.
- CL10.23 (2) 2.
- khả năng kháng khuẩn yếu (d=2÷4mm.
- khả năng kháng khuẩn trung bình (d=4÷14mm.
- khả năng kháng khuẩn mạnh (d=14÷24mm.
- Chủng vi khuẩn có tính đối kháng và sinh bacteriocin đối với cả 2 chủng vi khuẩn gây bệnh.
- (2) Chủng vi khuẩn có tính đối kháng đối với cả 2 chủng vi khuẩn gây bệnh.
- 3.2.2 Đối với vi khuẩn E.ictaluri.
- Kết quả có 42 chủng vi khuẩn lactic thể hiện tính đối kháng với E.ictaluri và 1 chủng có khả năng sinh bacteriocin.
- Trong đó, các chủng vi khuẩn lacic phân lập từ cá tra vẫn chiếm số lượng nhiều nhất với 22 chủng, sau đó là các chủng phân lập từ cá vồ đém với 13 chủng và 7 chủng phân lập từ cá lăng.
- các chủng phân lập từ cá trê và cá hú không thể hiện tính đối kháng với E.ictaluri.
- Đa số các chủng thể hiện tính đối kháng trung bình và yếu, tuy nhiên, chủng CL3.7 lại thể hiện khả năng đối kháng mạnh (d=17mm) và khả năng sinh bacteriocin trung bình (d=14mm) (Bảng 3).
- Các chủng vi khuẩn phân lập từ cá tra đa số thể hiện tính đối kháng cao so với các chủng vi khuẩn phân lập từ các loài cá khác..
- 3.2.3 Đối với cả 2 loài vi khuẩn A.hydrophila và E.ictaluri.
- Như vậy, chủng CT3.7 có khả năng sinh bacteriocin đối với cả hai chủng vi khuẩn gây bệnh..
- Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy, có 25 chủng vi khuẩn có khả năng kháng với cả 2 chủng gây bệnh;.
- với 17 chủng được phân lập từ cá tra, 4 chủng từ cá lăng và 4 chủng từ cá vồ đém (Bảng 1 và Bảng 2)..
- Hình 3: Đường tròn vô trùng tạo ra bởi vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin đối với vi khuẩn Ewardsiella ictaluri.
- dung dịch ly tâm từ vi khuẩn lactic không xử lý;.
- 9.2, 10.2: dung dịch ly tâm từ vi khuẩn lactic chuẩn pH (6.5-7).
- Bảng 3: Bảng đường kính vòng vô trùng gây ra bởi hoạt động kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn với Edwardsiella ictaluri.
- phân lập Tên chủng Khả năng đối kháng Khả năng sinh bacteriocin Đường kính vòng vô Độ nhạy.
- Sau khi đã tìm được 3 chủng có khả năng sinh bacteriocin, phục hồi và tách ròng trên đĩa thạch MRS, sau đó gửi mẫu đến Công ty TNHH Thương mại và Dịch vụ Nam Khoa, thực hiện định danh, giải trình tự gen 16S rRNA.
- Kết quả, 2 chủng CL2 và CL10.20 phân lập từ cá lăng có độ tương đồng theo thứ tự bp) và bp) với trình tự gen là.
- Trong khi đó, chủng CT3.7 phân lập từ cá tra có độ tương đồng bp) với trình tự gen là.
- Từ việc nghiên cứu để tìm ra các vi khuẩn lactic có tiềm năng làm probiotics với khả năng sinh chất kháng khuẩn, như bacteriocin, cho thấy, vi khuẩn lactic ngoài sự hiện diện từ các thức ăn lên men, còn tồn tại trong đường ruột cá và các loài thủy sản khác.
- (2008) đã phân lập được 106 chủng vi khuẩn lactic từ đường ruột cá biển, tôm và động vật thân mềm và tìm được 2 chủng Pediococcus pentosaceus và Enterococcus faecium sinh acid và H 2 O 2 kháng với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella sp.
- Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai (2012) đã phân lập được 45 dòng vi khuẩn từ dạ dày, ruột cá tra và cá rô phi thu từ các ao nuôi thâm canh.
- (2013) đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn lactic từ cá hồi và tôm cỏ.
- Dương Thị Kim Loan (2013) đã phân lập được 64 chủng vi khuẩn lactic từ ruột cá tra và cá rô phi được thu từ chợ và ao nuôi..
- Cùng với những nghiên cứu trên, nghiên cứu này đã phân lập được 96 chủng vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn nước ngọt, có khả năng kháng khuẩn E.coli., cho thấy không những trong đường ruột các loài nước mặn, mà ở các loài thủy sản nước ngọt cũng tồn tại vi khuẩn lactic với số lượng lớn.
- Bên cạnh đó, nghiên cứu còn tìm ra 46 chủng thể hiện tính đối kháng với A.hydrophila, 42 chủng đối kháng với E.ictaluri, trong đó, có đến 25 chủng có khả năng đối kháng với cả 2 chủng vi khuẩn gây bệnh này và 3 chủng vi khuẩn thể hiện khả năng sinh bacteriocin, với cả 3 chủng đều kháng A.hydrophila và chỉ 1 chủng kháng E.ictaluri.
- phương pháp khuếch tán giếng thạch với dịch huyền phù được lọc vô trùng, không sử dụng dịch huyền phù có chuẩn pH để xác định khả năng sinh bacteriocin thô, hơn nữa nghiên cứu vẫn chưa thực hiện đối với vi khuẩn E.ictaluri.
- Mặt khác, trong nghiên cứu này đã tìm ra được chủng L.fermentum JCM- 1173 từ đường ruột cá, có tính đối kháng và sinh bacteriocin cao không những với A.hydrophila mà còn với đối với E.ictaluri, trong đó, đường kính vòng tròn vô trùng với vi khuẩn E.ictaluri lớn hơn cả kháng sinh Doxycycline..
- Loài Lactobacillus reuteri, là vi khuẩn lên men hỗn tạp, sống tự nhiên trong đường ruột, được tìm thấy ở ruột động vật có vú và chim và được định danh vào năm 1980 bởi Kandler, bacteriocin được sinh ra bởi loài này là reuterin.
- Lactobacillus reuteriATCC 1428 có khả năng ức chế sự phát triển của Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella tiphimurium, Staphylococcus aureus và Vibrio cholera (Helen et al., 2010).
- Nghiên cứu này được xem như nghiên cứu khởi phát cho việc phát hiện L.reuteri tồn tại trong ruột động vật thủy sản, cụ thể là cá lăng sống tự nhiên với khả năng đối kháng với A.hydrophila và sinh bacteriocin..
- 96 chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập và tuyển chọn được 46 chủng đối kháng với A.hydrophila, 41 chủng đối kháng với E.ictaluri và 3 chủng sinh bacteriocin.
- Kết quả định danh 3 loài có khả năng sinh bacteriocin.
- Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về tiềm năng sử dụng làm probiotic của 2 loài vi khuẩn L.reuteri HFI-LD5 và L.fermentum JCM- 1173 như nghiên cứu hợp chất bacteriocin, thực hiện trong điều kiện in vivo, khảo sát khả năng làm chế phẩm sinh học,….
- “Sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic trong ruột một số loài cá da trơn nước ngọt có tiềm năng làm probiotic” (Mã số TSV2015-66 do Trường Đại học Cần Thơ tài trợ kinh phí..
- Phân lập và đánh.
- giá khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasius hypothalamus).
- Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp.
- có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ và đốm đỏ trên cá tra.
- Hiện trạng kháng thuốc kháng sinh trên hai loài vi khuẩn