- Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không. - Abstract: Thu thập các mẫu bệnh phẩm (máu và mô) của các bệnh nhân đã được xác định ung thư đại trực tràng và dạ dày. - Nhân bản một số exon quan tâm của gen MLH1 bằng kỹ thuật (phản ứng chuỗi nhờ polymeraza) PCR. - Phân tích và xác định các đột biến ở một số exon nghiên cứu bằng (phân tích đa hình cấu hình sợi đơn) SSCP và (tính đa hình độ dài đoạn giới hạn) RFLP. - Giải trình tự ADN một số mẫu đã được xác định đột biến bằng sàng lọc ở bước trên.. - Keywords: Di truyền học. - Di truyền học phân tử. - Đột biến gen. - Ung thư ruột kết. - Trong hơn 20 năm qua, những phát minh to lớn của di truyền học phân tử đã góp phần thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác ngày càng được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh, trong đó có bệnh ung thư.. - Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 10,1 triệu trường hợp mắc ung thư và có khoảng trên 6,7 triệu người chết do ung thư. - Riêng tại Việt Nam, mỗi năm phát hiện mới khoảng 200.000 người và khoảng 75.000 người chết vì bệnh ung thư [47].. - Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gen MLH1 được thực hiện ở rất nhiều quần thể người khác nhau. - Tại Việt Nam, xét nghiệm di truyền trong chẩn đoán ung thư nói chung và ung thu đại trực tràng nói riêng hầu như chưa được thực hiện. - Việc phát hiện những biến đổi di truyền trong các gen MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng có khuynh hướng di truyền, nhằm đưa ra những kết quả nghiên cứu bước đầu về gen MLH1 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và mở ra hướng nghiên cứu về các gen MMR khác, ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư ruột kết không polyp di truyền tại Việt Nam là rất cần thiết.. - Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thƣ ruột kết không polyp di truyền ở ngƣời Việt Nam”.. - Di truyền ung thƣ. - Khái niệm ung thư. - Ung thư k hông phả i là bệnh mà là một tên chung cho một nhóm các bệnh phát sinh từ các tế bào có tốc độ tăng trưởng không kiểm soát được, có được sự bất tử, xâm lấn và khả năng di căn. - Thuật ngữ “ung thư” theo nghĩa hẹp được dùng để chỉ những khối u có khả năng xâm lấn các mô xung quanh gồm các tế bào bình thường [17].. - Gen ung thư và gen ức chế khối u. - Gen ung thư (oncogenes) có thể định nghĩa là dạng gen đột biến làm tăng nguy cơ ung thư hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thư. - Các gen ung thư cũng có thể được coi như các dạng alen đặc biệt của các gen bình thường xuất hiện do kết quả của đột biến [3].. - Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer – CRC) được chia thành 3 dạng chính là rải rác, gia đình và di truyền.. - Ung thư đại trực tràng di truyền lại được chia thành 3 nhóm chính: Sinh polyp u tuyến theo dòng họ (FAP), Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hội chứng Lynch) và Hội chứng giống Lynch. - HNPCC là một hội chứng di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, gây nên bởi những đột biến dòng mầm gây bất hoạt ở những gen tham gia vào hệ thống sửa chữa bắt cặp sai (MMR): MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, trong đó chủ yếu là gen MLH1 và MSH2 [14].. - Tuy vậy, các u tuyến xuất hiện ở các bệnh nhân HNPCC có nguy cơ tiến triển thành ung thư cao hơn nhiều. - Những bệnh nhân mắc HNPCC thường hình thành ung thư khi còn khá trẻ, tuổi trung bình của chẩn đoán ung thư dạ dày là 56 tuổi, với ung thư u biểu mô đường ruột là loại bệnh lý phổ biến nhất được báo cáo. - HNPCC kết hợp với ung thư buồng trứng có độ tuổi chẩn đoán trung bình là 42,5, khoảng 30% được chẩn đoán trước tuổi 40 [33].. - Dạng siêu đột biến dễ phát hiện này được gọi là tính bất ổn vi vệ tinh (microsatellite instability - MSI) [25, 55].. - Đột biến gen MMR và nguy cơ ung thư. - Phân tích di truyền các gen MMR ở người cho thấy rằng trên 90% bệnh nhân mắc HNPCC là do đột biến ở hai gen MLH1 và MSH2. - Riêng gen MLH1 có tần số đạt đến 1/400 và gen MSH2 là 1/500 ở nhiều quần thể [41]. - Trong số tất cả các đột biến dòng mầm được báo cáo trong hội chứng Lynch, gen MLH1 có ảnh hưởng lớn nhất, ước tính chiếm khoảng 50% tổng số trường hợp, sau đó là đến MSH2 (40. - Như vậy, gen MLH1 là gen quan trọng nhất trong nghiên cứu ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC).. - Gen MLH1. - Gen MLH1 nằm trên NST số 3p21, tương ứng với vùng gen MutL ở E. - coli, nằm giữa các gen TRANK1 và LRRFIP2 với 19 exon, có kích thước khoảng 57,36 kb, mARN dài 2524 bp và protein được tổng hợp từ gen MLH1 gồm 756 axit amin.. - Sàng lọc các đột biến ở một số exon trên gen MLH1 bằng các kĩ thuật PCR-RFLP và PCR-SSCP, góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và mở ra hướng nghiên cứu tiếp theo cho các gen MMR khác nhằm ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng không polyp di truyền tại Việt Nam.. - Thu thập các mẫu bệnh phẩm (máu và mô) của các bệnh nhân đã được xác định ung thư đại trực tràng và dạ dày.. - Nhân bản một số exon quan tâm của gen MLH1 bằng kỹ thuật PCR.. - Phân tích và xác định các đột biến ở một số exon nghiên cứu bằng SSCP và RFLP.. - Mẫu mô và mẫu máu được thu thập từ các bệnh nhân ung thư đại trực tràng, dạ dày đến khám và điều trị tại Bệnh viện K và Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. - Giải trình tự gen. - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. - (A) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu mô. - (B) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu máu.. - Kết quả điện di cho thấy, ADN tổng số được tách chiết từ các mẫu khác nhau đều chỉ cho 1 băng duy nhất, đậm nét với kích thước xấp xỉ băng 23,1 kb của thang chuẩn λ/ Hind III. - Kết quả tối ưu phản ứng PCR. - Chúng tôi đã thu được nhiệt độ gắn mồi cho kết quả tốt nhất và ổn định nhất cho mỗi exon như sau: exon 19 T m = 58 0 C, exon 18 T m = 52 0 C, exon 17 T m = 60 0 C, exon 16 T m = 61 0 C,. - (A) Sản phẩm PCR exon 8 gen MLH1. - (B) Sản phẩm PCR exon 13 gen MLH1. - (A) Sản phẩm PCR exon 14 gen MLH1. - (B) Sản phẩm PCR exon 16 gen MLH1. - (A) Sản phẩm PCR exon 17 gen MLH1. - (B) Sản phẩm PCR exon 18 gen MLH1. - (A), (B) Sản phẩm PCR exon 19 gen MLH1. - Từ các kết quả thu được, có thể kết luận chúng tôi đã tiến hành nhân bản thành công 7 exon của gen MLH1: exon 8, exon 13, exon 14, exon 16, exon 17, exon 18 và exon 19 đúng kích. - Sản phẩm PCR nhân bản các exon có thể sử dụng được cho các bước sàng lọc đột biến gen MLH1 tiếp theo.. - Kết quả phân tích SSCP. - (A) Kết quả phân tích SSCP exon 8 gen MLH1. - (B) Kết quả phân tích SSCP exon 13 gen MLH1. - Hình chữ nhật màu đỏ chỉ vị trí đột biến. - (A) Kết quả phân tích SSCP exon 16 gen MLH1. - (B) Kết quả phân tích SSCP exon 14 gen MLH1. - (A) Kết quả phân tích SSCP exon 17 gen MLH1. - (B) Kết quả phân tích SSCP exon 18 gen MLH1.. - Kết quả phân tích SSCP exon 19 gen MLH1. - Qua các kết quả phân tích SSCP thu được cho thấy, chúng tôi không phát hiện được sự sai khác nào từ các mẫu nghiên cứu của các exon 8, exon 16, exon 17, exon 18 và exon 19 gen MLH1. - Kết quả phân tích đột biến bằng PCR – RFLP 3.4.1. - Kết quả xử lý exon 16 bằng enzym MspI. - Ảnh điện di Hinh 10 cho thấy trong 50 mẫu chúng tôi nghiên cứu không có mẫu nào mang gen đột biến ở vị trí bộ ba mã hóa 582 của exon 16 gen MLH1. - Kết quả xử lý exon 19 bằng enzym CviQI. - Kết quả trên tương ứng với dự đoán là tất cả các đối tượng nghiên cứu đều mang kiểu gen đồng hợp tử C/C, tức là không có cá thể nào mang gen đột biến ở vị trí bộ ba mã hóa 718 của exon 19.. - Kết quả xử lý exon 18 bằng enzym CviQI. - Kết quả chúng tôi thu được khi tiến hành phản ứng cắt với mẫu T19 và T20 có số lượng băng giống với kết quả chúng tôi dự đoán nếu có đột biến xảy ra tại vị trí nucleotit 2104 (G A) với kiểu gen dị hợp G/A. - Để khẳng định kết quả thu được, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự ADN exon 18 từ hai bệnh nhân này.. - Kết quả giải trình tự ADN và so sánh trình tự. - Phân tích trình tự exon 13 của mẫu mô từ bệnh nhân số 6. - Ở mẫu mô bệnh phẩm của người số 6, từ kết quả giải trình tự exon 13 (ký hiệu mẫu:. - Đây là đột biến ở thể dị hợp tử thay thế nucleotit dạng đồng hoán dẫn tới đột biến nhầm nghĩa: sự thay đổi nucleotit có thể dẫn tới sự thay thế axit amin tương ứng Threonin thành Isoleucine (hoặc Leu thành Phe. - Tuy nhiên, chúng tôi không phát hiện được đột biến dịch khung ở trình tự này.. - Kết quả phân tích trình tự exon 14 từ mẫu T19. - (B) Trình tự xuôi của exon 14 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay thế tại vị trí 176C>G và một đột biến thay thế ở vị trí 185T>A. - Phân tích trình tự exon 18 từ mẫu T20. - Kết quả cho thấy sự phát sinh khối u tại mô đại trực tràng của bệnh nhân này chưa thấy có mối liên quan với sự biến đổi của exon 18 gen MLH1. - Để có kết luận chắc chắn hơn về điều này, cần giải trình tự của các phân đoạn khác của gen MLH1.. - So sánh trình tự exon 18 của mẫu mô ung thư của bệnh nhân 20 và mô người bình. - Kết quả so sánh trình tự exon 18 của mẫu máu và mẫu mô từ bệnh nhân số 19 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. - Từ những kết quả thu được với việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSCP và PCR-RFLP trong phân tích đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai. - Đã phát hiện được các mẫu phân đoạn gen MLH1 từ những bệnh nhân có mô hình phân tích băng điện di khác biệt ở các exon 13 (mẫu 13T6) và exon 14 (mẫu 14T18 và 14T19) gen MLH1 khi so sánh với đối chứng, sử dụng kỹ thuật PCR-SSCP.. - Đã phát hiện được các mẫu phân đoạn gen MLH1 từ những bệnh nhân có mô hình phân tích băng điện di khác biệt ở exon 18 gen MLH1 từ các bệnh nhân số 19 và bệnh nhân số 20 khi so sánh với đối chứng, sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP.. - Đã phát hiện được một đột biến ở thể dị hợp tử thay thế nucleotit G>A tại vị trí 203 trên exon 13 từ mẫu mô bệnh phẩm của bệnh nhân số 6 (mẫu 13T6), một đột biến thay thế nucleotit C>G tại vị trí 176 và một đột biến thay thế T>A ở vị trí 185 thuộc exon 14 gen MLH1 từ mẫu mô bệnh phẩm người số 19 (mẫu 14T19) bằng giải trình tự gen.. - Điều này chứng tỏ những đột biến mà chúng tôi xác định được đều là các đột biến soma.. - Trên cơ sở kết quả nghiên cứu này, chúng tôi có một số kiến nghị như sau:. - Tiếp tục tiến hành phân tích đột biến ở các exon còn lại của gen MLH1 bằng kỹ thuật PCR-SSCP và các kỹ thuật di truyền khác (SSR, HET, DGGE. - để xác định các dạng đột biến thuộc gen MLH1 có thể có ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam.. - Mở rộng nghiên cứu các gen MMR khác (MSH2, MSH6…) nhằm xây dựng một cơ sở dữ liệu về đột biến gen MMR ở người Việt Nam.. - (2003), “Hereditary non-polyposis colorectal cancer:. - (2003) “Hereditary colorectal cancer”, N Engl Med