- SỰ SẢN XUẤT IAA VÀ SIDEROPHORE CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN LIÊN HIỆP THỰC VẬT VÀ ẢNH HƯỞNG LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA CÂY BẮP (Zea mays L.) TRỒNG TRONG CHẬU. - Cây bắp, IAA, siderophore, vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật, vi khuẩn liên hiệp thực vật Keywords:. - Năm mươi lăm dòng vi khuẩn liên hiệp cây bắp đã được kiểm tra sự sản xuất IAA với thuốc thử Fe-HClO 4 và Fe-H 2 SO 4 . - Khi có mặt trp, có 16 dòng đã biểu hiện sự giảm sản xuất IAA đáng lưu ý. - Mười hai dòng đã được tiếp tục khảo sát khả năng sản sinh siderophore trên môi trường thạch CAS theo công thức cải biên bởi Srivastava et al. - (2013) nhưng chỉ có một dòng thể hiện khả năng này. - Dải chuyển màu do dòng DDN10b tạo ra giữa hai môi trường PS và CAS ở 2 DAI là 1,30±0,10 cm và ở 4 DAI là 2,67±0,21 cm.. - Năm dòng tiềm năng đã được nghiên cứu ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của cây bắp trồng trong chậu. - Tất cả các dòng đều làm tăng chiều cao, khối lượng thân lá và rễ tươi, khối lượng chất khô của cây một tháng tuổi so với đối chứng. - Sự sản xuất IAA và siderophore của các dòng vi khuẩn liên hiệp thực vật và ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của cây bắp (Zea mays L.) trồng trong chậu. - Ngày nay, người ta đã phát hiện được nhiều loài vi khuẩn liên hiệp thực vật (PAB- Plant Associated Bacteria), bao gồm cả vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh, có khả năng cải thiện sự tăng trưởng của thực vật. - Chúng có thể ví như các loại phân bón tổng hợp hoặc thuốc trừ sâu, thuốc trừ cỏ nhưng bên cạnh đó lại có thể hỗ trợ cho việc duy trì tính bền vững trong năng suất cây trồng và sự an toàn của môi trường (Singh, 2013). - Cơ chế PGP gián tiếp chính là sự đối kháng sinh học (bioantagonist) hay kiểm soát sinh học (biocontrol), có tác dụng giúp cây chủ hạn chế tác nhân gây bệnh hay cỏ dại thông qua sự sản xuất các kháng sinh, siderophore hay cyanide (Jha et al., 2013). - Như vậy, nếu sử dụng các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPB- Plant Growth Promoting Bacteria) làm phân bón thì ngoài tác dụng bổ sung NPK cho cây, sản phẩm còn có tác dụng bổ sung nguồn kích tố thực vật như IAA (indole-3-acetic acid) hay thúc đẩy sự hòa tan các khoáng chất có chứa Ca hoặc Fe nhờ vào các phức chất vòng càng (chelate) như các siderophore ngoại sinh từ vi khuẩn (Hinsinger et al., 2009). - Ở thực vật, IAA được sản xuất ở lá non, thân và hạt thông qua các phản ứng decarboxyl hóa và transamin từ tiền chất tryptophan (trp) (Lebuhn và Hartmann, 1993). - Các lộ trình phụ thuộc trp đã được phát hiện và nghiên cứu ở thực vật và nhiều vi khuẩn. - Trong đó, lộ trình IAM được cho rằng có liên quan đến các vi khuẩn gây u thực vật, và lộ trình IpyA thường gặp ở các PAB có lợi cho thực vật (Lambrecht et al., 2000). - Ngược lại, đối với lộ trình không phụ thuộc trp, mặc dù đã được Prinsen et al. - Tương tự như cách thức huy động các chất điều hòa sinh trưởng, ngoài khả năng sản xuất và sử dụng các siderophore nội sinh (phytosiderophore), thực vật còn có thể tận dụng các lợi ích mà các siderophore do vi khuẩn sản xuất đem lại.. - Các vi khuẩn thuộc Gram âm như Pseudomonas và Enterobacter và vi khuẩn Gram dương như Bacillus và Rhodococcus đã được biết đến khả năng sản xuất siderophore (Saharan và Nehra, 2011). - Các phương pháp phát hiện định tính và định lượng IAA hoặc siderophore do vi khuẩn sản xuất hiện nay chủ yếu dựa trên phản ứng màu với các loại thuốc thử và phép đo màu thông qua máy đo mật độ quang (optical density - OD) ở bước sóng thích hợp.. - Có tổng cộng 54 dòng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan calcium orthophosphate liên hiệp với cây bắp trồng trên đất xám của vùng Đông Nam Bộ đã được tuyển chọn và nhận diện (Dang Thi Ngoc Thanh và Cao Ngoc Diep, 2014a và 2014b). - Tuy nhiên, đặc tính sinh tổng hợp IAA của các dòng này đã được khảo nghiệm trên hai loại môi trường nuôi cấy khác nhau: môi trường Burk’s không đạm lỏng, không bổ sung tryptophan đối với vi khuẩn đất vùng rễ, và môi trường Burk’s không đạm lỏng, có bổ sung 100 mg trp /L đối với vi khuẩn nội sinh.. - Do vậy, để tiếp tục hoàn thiện việc đánh giá khả năng PGP của các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn, loạt khảo nghiệm này đã được thực hiện với các mục đích: (1) so sánh khả năng sản xuất IAA của các dòng trong điều kiện có hoặc không có trp nhằm tìm ra một giao thức (protocol) chung, (2) xác định khả năng sản xuất siderophore của các dòng nổi trội và (3) bước đầu đánh giá khả năng PGP in vivo của một số dòng tốt nhất trên cây bắp trồng trong chậu ở giai đoạn 0 – 1 tháng tuổi.. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - Các thí nghiệm in vitro được thực hiện từ tháng 9 đến tháng 12 năm 2014 và các thí nghiệm trên cây bắp trong chậu được tiến hành từ tháng 1 đến tháng 3 năm 2015. - Khảo nghiệm khả năng tổng hợp IAA trên môi trường Burk’s không đạm lỏng, không hoặc có bổ sung 100 mg trp/L đã được tiến hành trên 55 dòng PAB, bao gồm 30 dòng vi khuẩn nội sinh và 24 dòng vi khuẩn đất vùng rễ đã được tuyển chọn và công bố (Dang Thi Ngoc Thanh và Cao Ngoc Diep, 2014a và 2014b) cùng với 1 dòng vi khuẩn đất vùng rễ PDN1a hiện đang được lưu trữ tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. - Các dòng này có nguồn gốc từ cây bắp và đất vùng rễ cây bắp trồng trên đất xám tại 6 tỉnh thành vùng Đông Nam Bộ và tương đồng trình tự gene 16S rRNA với các PAB đã được báo cáo và lưu trữ dữ liệu trong NCBI ở mức 97% trở lên. - Đặc tính sản xuất IAA của mỗi dòng được định lượng thông qua phép đo màu theo phương pháp của Gordon và Weber (1951) với thuốc thử Fe- HClO 4 và thuốc thử Fe-H 2 SO 4 . - Chuẩn bị mẫu bằng cách hút 2,5 mL dịch huyền phù của mỗi dòng vi khuẩn đã tiền cấy [mật số đạt khoảng CFU/mL, tương ứng với chuẩn McFarland 0,5 (Sutton, 2011)] đem chủng vào các ống Falcon chứa 25 mL môi trường Burk’s không đạm lỏng trong điều kiện không có hoặc có bổ sung 100 mg/L trp. - 2.2 Khảo sát khả năng sản xuất siderophore in vitro. - Dựa trên kết quả định lượng các khả năng cố định đạm, hòa tan phosphate và tổng hợp IAA. - cũng như kết quả định danh thông qua tương đồng trình tự gene 16S rRNA, có 12 dòng trong tổng số 55 dòng PAB đã được tiếp tục lựa chọn để khảo sát định tính khả năng sản sinh siderophore trên môi trường thạch CAS do Srivastava et al. - Tiến hành nhỏ 50 µL dịch huyền phù của mỗi dòng vi khuẩn đã tiền cấy 2 ngày trong môi trường PS lỏng (10 g peptone, 20 g sucrose) lên bề mặt thạch đĩa CAS đã hấp tiệt trùng. - Sự xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường CAS và sự xuất hiện vòng halo màu tím đến hồng hoặc cam chỉ thị cho sự sản sinh siderophore của vi khuẩn (Machuca và Milagres, 2003). - Tiếp tục khảo sát sự sản xuất siderophore của các dòng theo phương pháp cấy ria vào nửa đĩa chứa môi trường dinh dưỡng (PS) trên thạch đĩa PS-CAS (Srivastava et al., 2013). - Sự chuyển màu từ màu xanh đặc trưng của nửa thạch CAS sang tím, hồng hoặc cam chỉ thị sự sản sinh siderophore của vi khuẩn. - Đo chiều rộng của dải chuyển màu để đánh giá và so sánh khả năng sản xuất siderophore giữa các dòng vi khuẩn.. - 2.3 Khảo nghiệm đặc tính PGP in vivo trên cây bắp trồng trong chậu. - Năm trong số 12 dòng vi khuẩn đã qua khảo nghiệm khả năng sinh siderophore được tiếp tục tiến hành khảo nghiệm đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật trên cây bắp giống Wax48 trồng trong chậu. - 2.3.1 Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn Mỗi dòng vi khuẩn được tăng sinh trong bình tam giác 250 mL chứa 150 mL môi trường (lỏng) đã sử dụng để phân lập chúng (LGI/NFb đối với các vi khuẩn nội sinh, Burk’s không đạm/NBRIP đối với vi khuẩn đất vùng rễ) cho đạt mật số khoảng CFU/mL (chuẩn McFarland 0,5).. - 2.3.2 Xử lý hạt và chủng vi khuẩn vào hạt nảy mầm. - Có 10 nghiệm thức được thực hiện, bao gồm: bắp được chủng vi khuẩn (5 nghiệm thức tương ứng 5 dòng vi khuẩn). - bắp không được chủng vi khuẩn nhưng được bón hoặc 100% phân khoáng NPK (4 nghiệm thức tương ứng 4 mức phân), và một nghiệm thức đối chứng âm, không bón phân cũng không chủng vi khuẩn (1 nghiệm thức). - Đánh giá khả năng PGP của các dòng PAB dựa trên chiều cao cây, chiều dài bộ rễ, diện tích lá, khối lượng tươi của thân lá và khối lượng tươi của rễ, khối lượng chất khô. - Số liệu được thu thập khi cây bắp con kết thúc giai đoạn sinh trưởng chậm (khoảng 9 lá, sau 30 ngày gieo hạt).. - 3.1 Khả năng sản xuất IAA in vitro của các dòng PAB. - Cả 55 dòng PAB đã khảo sát đều có khả năng tổng hợp IAA trong điều kiện có hoặc không có bổ sung 100 mg/L trp. - Trong đó, có 16 dòng PAB (29,09%) biểu hiện sự giảm lượng IAA bình quân khi bổ sung 100 mg/L trp vào môi trường nuôi cấy so với đối chứng không bổ sung trp. - Đối với mỗi dòng, trong cùng một đợt đo mẫu, lượng IAA được tổng hợp ở hai lô thí nghiệm (có hay không có bổ sung trp) cũng cho thấy sự khác biệt (Hình 1A, 1B) chứng tỏ sự đa dạng trong cơ chế hoạt động sinh tổng hợp IAA phụ thuộc nhiều yếu tố như thành phần môi trường hay thời gian nuôi cấy. - Tuy chưa biết rõ về lộ trình không phụ thuộc trp nhưng khả năng tổng hợp IAA của 55 dòng PAB trong nghiên cứu này cũng tương tự như quan sát của Horemans và Vlassak (1985) trên Azospirillum brasilense: các vi khuẩn này có khả năng tổng hợp IAA ở mức cao mà không cần bổ sung trp với điều kiện môi trường nuôi cấy phải có sự hiện diện của NH 4 + và hiếu khí. - Năm mươi lăm dòng PAB đã tuyển chọn này vốn là những vi khuẩn có khả năng cố định đạm tốt, để có thể phát triển trong môi trường Burk’s không đạm, chúng cần phải hoạt hóa cơ chế BNF để chuyển hóa N 2. - Lộ trình IAA phụ thuộc trp đã được phát hiện rộng rãi. - Hầu hết các nghiên cứu về sự tổng hợp IAA ở các vi khuẩn đều cho thấy có sự gia tăng khả năng sản xuất loại auxin này trong điều kiện nuôi cấy có bổ sung trp. - Tuy nhiên, trong một vài nghiên cứu có sự xuất hiện một số ít các dòng vi khuẩn biểu thị sự giảm khả năng sản xuất IAA khi bổ sung trp vào môi trường nuôi cấy so với các đối chứng không bổ sung, ví dụ như nghiên cứu của Ahmad et al. - Sự giảm sản xuất IAA ở một nồng độ tryptophan nhất định hay một nồng độ IAA nhất định có thể được lý giải theo cơ chế mà Lambrecht et al. - (2000) đã tổng hợp dựa trên mô hình các vi khuẩn Azospirillum sản xuất IAA không phụ thuộc trp mà Prinsen et al. - trình tự đáp ứng với auxin AuxRE (auxin- responsive element) và được điều hòa theo kiểu kiểm soát dương tính ngược (positive feedback control): IAA trong môi trường kích thích sản xuất IAA. - Tuy nhiên, đồng thời với tăng sản xuất IAA thì các tiền chất IAA (IAA-precursor) ví dụ như trp cũng được tạo ra. - Do vậy, sự giới hạn trong sản xuất IAA đã được xem là kết quả của một sự tương tác phức tạp giữa nhiều yếu tố chưa được biết trong lộ trình nhánh của lộ trình IpyA như các enzyme, các gene,… kể cả nồng độ các tiền chất IAA có trong môi trường.. - Đường chuẩn 0 - 2,5 mg/L IAA với Fe-HClO 4 (C) và với Fe-H 2 SO 4 (D) Qua sự khảo sát trở lại khả năng sản xuất IAA. - của 55 dòng PAB, có 12 dòng được tiếp tục chọn lựa cho việc khảo sát khả năng sản xuất siderophore. - hai nhóm đối tượng: vi khuẩn đất vùng rễ (25 dòng + 1 đối chứng) và vi khuẩn nội sinh (30 dòng + 1 đối chứng). - Bảng 1: Đặc tính PGP in vitro của 12 dòng PAB cây bắp trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ Tên. - 3.2 Khả năng sản xuất siderophore in vitro của các dòng PGPB. - Trong điều kiện khan hiếm sắt, một số vi khuẩn, nấm và một số Hòa thảo có khả năng sản xuất siderophore để hình thành phức hợp hòa tan Fe 3+ từ khoáng sản. - PGPB được khảo sát, chỉ có dòng DDN10b tạo được vòng halo trên môi trường CAS cải biên sau 48 giờ như mô tả của Machuca và Milagres (2003).. - Các dòng VTN7, TDB13 và DTN1b có khả năng phát triển trên môi trường thạch CAS nhưng không tạo vòng sáng (Hình 2A, 2B). - Có một số tác giả cho rằng việc nhỏ trực tiếp dịch huyền phù vi khuẩn lên thạch CAS sẽ khiến vi khuẩn tiếp xúc. - trực tiếp với một loại môi trường có tính độc, có thể gây chết đối với một số dòng. - Vi khuẩn được cấy ria trên nửa tấm thạch chứa môi trường dinh dưỡng (PS) và siderophore trong sản phẩm tiết (nếu có) sẽ khuếch tán dễ dàng sang nửa tấm thạch CAS kế bên và làm biến đổi màu xanh của chất chỉ thị. - So sánh giá trị này giữa các dòng (nếu có) có thể giúp sơ bộ đánh giá và tuyển các chọn dòng có tiềm năng sản xuất siderophore.. - Hình 2: Phản ứng tạo màu của các PAB trên môi trường thạch CAS và thạch PS-CAS Phản ứng tạo màu với thuốc thử CAS ngay sau khi nhỏ giọt (A) và vòng halo ở 5 DAI (B). - 3.3 Đặc tính PGP in vivo của các PAB trên cây bắp trồng trong chậu. - Năm dòng PAB có kết quả định lượng đặc tính PGP cao đã được tuyển chọn cho việc đánh giá khả năng PGP trên cây bắp con trồng trong chậu, gồm có dòng DTN1b (tương đồng với Azotobacter vinelandii), dòng DDN10b (tương đồng với Burkholderia spp. - Riêng dòng TDB13, mặc dù có kết quả cố định đạm và tổng hợp IAA cao nhưng không được tiếp tục khảo sát vì có sự tương đồng cao với vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans, một loài có khả năng gây bệnh cơ hội cho người. - Về tác động của các dòng vi khuẩn, ngoại trừ DTN1b, các dòng còn lại đều làm gia tăng chiều cao cây so với đối chứng âm. - Ngược lại, ở nghiệm thức chủng vi khuẩn DTN1b, cây bắp con có bộ rễ phát triển dài nhất:. - Hiện tượng này không được quan sát thấy trên các cây có chủng vi khuẩn chứng tỏ khả năng bù đắp dinh dưỡng cho cây bắp trong giai đoạn 0 – 1 tháng tuổi của các dòng PAB đã tuyển chọn.. - Về khối lượng tươi của thân lá và rễ, có thể nhận thấy không một dòng vi khuẩn nào có hiệu quả ngang bằng với mức bón 100% NPK hóa học.. - Tuy vậy, nếu so sánh với mức bón 75 % NPK, dòng vi khuẩn nội sinh VTN2b cho khối lượng thân lá đạt 115,91% và dòng DDN10b cho hiệu quả đạt 83,76%. - Tương tự, trên sinh khối tươi của rễ, việc chủng cho cây bắp với các dòng VTN2b, TDB1 và DDN10b đều cho hiệu quả tốt hơn so với mức bón 75% NPK, tăng từ 7 – 19% so với nghiệm thức này (Hình 4).. - Bảng 2: Tác động các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn và các mức bón phân NPK trên cây bắp trồng trong chậu. - (cm 2 ) Khối lượng. - Hình 3: Cây bắp thu được qua 10 nghiệm thức, trong đó cây bắp bón 100% NPK là tốt nhất (bìa phải). - Hình 4: Hiệu quả của các dòng vi khuẩn và các mức phân hóa học trên khối lượng thân lá tươi và khối lượng rễ tươi của cây bắp con trồng trong chậu. - Hình 5: Hiệu quả của các dòng vi khuẩn và các mức phân hóa học trên khối lượng chất khô của cây bắp con trồng trong chậu. - So với đối chứng không chủng vi khuẩn và không bón phân hóa học, các dòng VTN2b, DDN10b và TDB1 cho hiệu quả trên lượng chất khô của cây bắp con tăng gấp lần. - (2011) đã đạt được trên cây bắp con tuổi trồng trong chậu và ngoài đồng, giai đoạn 4 – 5 tuần tuổi.. - Trong nghiệm thức chủng vi khuẩn SUT 47 ở mật số 10 8 CFU vào hạt, lượng chất khô của rễ và thân lá cây bắp con đã tăng từ lần so với đối chứng. - Dòng SUT 47 vốn được phân lập từ rễ cây bắp trồng tại Đông Bắc Thái Lan và đã thể hiện khả năng tổng hợp IAA cũng như ACC- deaminase cao nhất trong tổng số 153 dòng PGP đã được khảo sát.. - (2014) về tác động của các vi khuẩn PGP trên sinh khối cây bắp con trồng trong chậu cũng cho thấy sự gia tăng có ý nghĩa về khối lượng chất khô/tươi của rễ, gấp lần so với đối chứng. - Các chủng tốt nhất đều thể hiện khả năng sản xuất IAA cao. - (2012) còn có khả năng cố định đạm, và hai chủng CNPSo 2480 (Enterobacter sp.) và CNPSo 2481 (Bacillus sp.) trong nghiên cứu của Szilagyi- Zecchin và ctv. - (2014) ngoài khả năng BNF, còn có thể sản xuất siderophore và các enzyme thủy giải có tác dụng kháng nấm.. - Năm mươi lăm dòng vi khuẩn liên hiệp cây bắp đã được khảo sát đều có khả năng tổng hợp IAA trong điều kiện không có hoặc có bổ sung tryptophan. - sản xuất IAA và 16 dòng biểu hiện sự giảm sản xuất IAA khi bổ sung 100 mg/L trp vào môi trường nuôi cấy Burk’s không đạm lỏng. - Trong 12 dòng được tiếp tục khảo sát khả năng sản sinh siderophore trên môi trường thạch CAS cải biên, chỉ có dòng DDN10b thể hiện khả năng này. - Năm dòng có hoạt tính PGP cao đã được tiếp tục thử nghiệm trên cây bắp trồng trong chậu. - Tất cả các dòng đều làm gia tăng có ý nghĩa thống kê chiều cao cây, khối lượng thân lá và rễ tươi, khối lượng chất khô so với đối chứng âm và nghiệm thức bón 25% NPK.. - Ba dòng tốt nhất bao gồm VTN2b, DDN10b và TDB1 có tác động trên sinh khối khô của cây tương đương với mức bón 50 – 75% phân NPK hóa học nên được đề xuất cho các thử nghiệm tiếp theo trên cây bắp canh tác ngoài đồng.