- (ii) Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của mô sẹo là môi trường MS + NAA 2 mg/l kết hợp với 2,4-D 7 mg/l. - (iii) Sự tạo phôi soma (và tái sinh chồi cây tre Rồng) từ mô sẹo trên môi trường MS bổ sung TDZ 0,01 mg/l đạt được 33,33% vào thời điểm 3 tuần sau khi cấy, các chồi trong môi trường này sinh trưởng và phát triển tốt.. - 2.2.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của môi trường MS bổ sung 2,4-D và NAA trên sự hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào. - Các nghiệm thức được bố trí như sau:. - MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 5 mg/l 6. - MS +NAA 5 mg/l +2,4-D 2 mg/l 3. - MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 6 mg/l 7. - MS +NAA 6 mg/l +2,4-D 2 mg/l 4. - MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l 8. - MS +NAA 7 mg/l +2,4-D 2 mg/l 5. - MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 8 mg/l 9. - MS +NAA 8 mg/l +2,4-D 2 mg/l Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo và tỷ lệ mô sẹo rắn chắc vào các thời điểm 2, 4, 6, và 8 tuần sau khi cấy.. - 2.2.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả của môi trường MS bổ sung 2,4-D, NAA và TDZ lên sự phát triển cụm mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào. - Chọn các cụm mô sẹo (callus) rắn chắc, có màu sắc, kích thước tương đương nhau (0,3 cm) được tạo ra từ lớp mỏng tế bào của thân chồi non in vitro ở thí nghiệm 1 để tiến hành thí nghiệm. - Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, với 7 nghiệm thức, 4 lần lặp lại, 2 keo/lần lặp lại, mỗi keo cấy 4 mẫu mô sẹo có kích thước (5 x 5 mm). - MS +2,4-D 7 mg/l +NAA 2 mg/l +TDZ. - MS +2,4-D 7 mg/l +NAA 2 mg/l +TDZ 0,04 mg/l 4. - MS +2,4-D 7 mg/l +NAA 2 mg/l +TDZ 0,08 mg/l 5. - MS +2,4-D 7 mg/l +NAA 2 mg/l +TDZ 0,12 mg/l 6. - MS +2,4-D 7 mg/l +NAA 2 mg/l +TDZ 0,16 mg/l 7. - MS +2,4-D 7 mg/l +NAA 2 mg/l +TDZ 0,20 mg/l. - Chỉ tiêu theo dõi: Đặc điểm của cụm mô sẹo (màu sắc, hình dạng, cấu trúc), đường kính trung bình của mô sẹo vào các thời điểm tuần sau khi cấy.. - 2.2.3 Thí nghiệm 3: Hiệu quả của môi trường MS bổ sung TDZ lên sự tạo phôi soma và tái sinh chồi của cụm mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào. - Chọn các cụm mô sẹo rắn chắc, có kích thước và màu sắc tương đương nhau từ thí nghiệm 2. - với 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 keo, mỗi keo cấy 2 cụm mô sẹo có kích thước và màu sắc tương đương nhau. - 3.1 Hiệu quả của môi trường MS bổ sung 2,4-D và NAA trên sự hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào. - Đối với cây tre Rồng để tạo được mô sẹo thì cần cắt mẫu thành những lớp mỏng gần với mắt của thân tre. - Kết quả cho thấy những lát mỏng của thân chồi non trên môi trường đối chứng không có sự phát triển cũng như không có sự biến đổi cấu trúc để hình thành mô sẹo mà các mẫu cấy này bị hóa nâu và chết dần sau 2 tuần nuôi cấy. - Các nghiệm thức MS bổ sung NAA và 2,4-D đều có sự biến đổi và hình thành mô sẹo.. - Đầu tiên mô sẹo phát sinh ở các vị trí mép cắt của lớp mỏng và lan dần vào phía bên trong của mô thân, phần lớn mô sẹo có dạng mềm, rời rạc hoặc kết dính mềm có màu nâu vàng và không có cấu trúc rõ ràng.. - mẫu tạo mô sẹo. - Kết quả ở Bảng 1 cho thấy ở thời điểm 2 tuần sau khi cấy (TSKC), tỷ lệ % mẫu tạo mô sẹo cao nhất (khoảng 25,3%) ở các nghiệm thức MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l và MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 8 mg/l và khác biệt có ý nghĩa thống kê 1% so với các nghiệm thức còn lại, trừ nghiệm thức MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 6 mg/l (22,7. - Các nghiệm thức còn lại có tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo biến động từ 12,0. - 17,3% và giữa các nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa thống kê.. - Kết quả ở Bảng 1 cũng cho thấy vào thời điểm 4 TSKC, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo có sự gia tăng ở các nghiệm thức. - Môi trường MS có nồng độ 2,4-D 2 mg/l kết hợp với NAA với các nồng độ khác nhau cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo tăng khi nồng độ NAA tăng, ở nghiệm thức MS +2,4-D 2 mg/l +NAA 5 mg/l là 30,9% đến nghiệm thức MS +2,4-D 2 mg/l +NAA 6 mg/l tăng lên 40%. - Theo Jacob (1993) sự hình thành mô sẹo là phản ứng tăng sinh hỗn loạn của mô bị thương trong điều kiện có tác nhân kích thích giúp hình thành mô sẹo. - Để cảm ứng mô sẹo từ mẫu cấy 2,4-D là loại auxin thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy (Ramanayake và Wanniarachchi. - mẫu tạo mô sẹo theo thời gian. - Nghiệm thức Thời gian (tuần sau khi cấy). - MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 5 mg/l 12,0 b 30,9 e. - MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 6 mg/l 12,0 b 40,0 d. - MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l 12,0 b 30,9 de. - MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 8 mg/l 12,0 b 29,3 e. - MS +NAA 5 mg/l +2,4-D 2 mg/l 17,3 b 56,0 c. - MS +NAA 6 mg/l +2,4-D 2 mg/l 22,7 a 66,7 b. - MS +NAA 7 mg/l +2,4-D 2 mg/l 25,3 a 81,3 a. - MS +NAA 8 mg/l +2,4-D 2 mg/l 25,3 a 70,7 b. - Môi trường MS bổ sung nồng độ NAA 2 mg/l kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ khác nhau có hiệu quả cao lên tỷ lệ tạo mô sẹo so với nghiệm đối chứng và các nghiệm thức MS +2,4-D 2 mg/l kết hợp với NAA ở các nồng độ (5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l và 8 mg/l), ở mức ý nghĩa ở mức 1%. - Môi trường MS bổ sung nồng độ 2,4-D càng tăng thì cho hiệu quả tạo mô sẹo càng cao, tuy nhiên càng tăng dần nồng độ 2,4-D đến mức 2,4-D 8 mg/l (nghiệm thức MS +NAA 2 mg/l + 2,4-D 8 mg/l) thì tỷ lệ tạo mô sẹo bắt đầu giảm. - Tỷ lệ đạt mô sẹo trung bình cao nhất là 81,3% trên môi trường MS bổ sung NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l, khác biệt có ý nghĩa 1% so với các tất cả các nghiệm thức khác. - Kết quả của thí nghiệm cho thấy môi trường MS bổ sung cố định nồng độ NAA và kết hợp với nồng độ 2,4-D tăng dần có hiệu quả trong sự phản phân hóa mô để tạo ra mô sẹo từ lớp mỏng thân chồi tre Rồng.. - mẫu tạo mô sẹo cứng chắc. - Vào thời điểm 4 TSKC các mô sẹo ở các nghiệm thức thí nghiệm có kích thước hình dạng, màu sắc và cấu trúc gần giống nhau, đa số các mẫu mô sẹo được hình thành có cấu trúc kết dính lại, nhũng nước, có màu vàng nhạt. - Tuy nhiên, ở thời điểm 8 TSKC, các mẫu phát sinh mô sẹo có tính chất, cấu trúc và màu sắc khác nhau, có thể là: 1- dạng mô rất xốp, màu trắng sữa và các tế bào rời rạc nhau (friable callus) hay 2- phát triển thành một khối riêng có cấu trúc rắn chắc (compact callus) hoặc 3- dạng trung gian có cấu trúc rắn chắc, xốp và mọng nước xen lẫn trong môi trường nuôi cấy. - Dây chính là phản ứng tăng sinh hỗn loạn của mô bị thương trong điều kiện có tác nhân kích thích giúp hình thành mô sẹo trước khi phát triển và phân hóa.. - Kết quả ở bảng 2 cho thấy các nghiệm thức đều có mẫu tạo mô sẹo rắn chắc nhưng với tỷ lệ khác nhau và khác biệt có ý nghĩa ở mức 1% so với nghiệm thức đối chứng (0. - Nghiệm thức cho tỷ lệ mô sẹo cứng chắc cao nhất là nghiệm thức MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 6 mg/l và MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l, lần lượt là. - Nghiệm thức cho tỷ lệ mô sẹo cứng chắc đạt thấp nhất sau 8 tuần nuôi cấy là nghiệm thức MS +2,4-D 2 mg/l +NAA 5 mg/l, 17%. - Tuy nhiên, nghiệm thức MS +2,4-D 2 mg/l +NAA 6 mg/l, đạt 29,0%, lại không khác biệt ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 2,4-D 2 mg/l +NAA 7 mg/l, đạt 27,8%, và nghiệm thức MS +2,4-D 2 mg/l +NAA 8 mg/l, đạt 23,33%. - Như vậy, kết quả của thí nghiệm cho thấy tỷ lệ mô sẹo cứng chắc tăng khi cố định nồng độ NAA ở 2 mg/l và tăng dần nồng độ 2,4-D lên từ 6 mg/l đến 7 mg/l và bắt đầu giảm ở nồng độ 2,4-D 8 mg/l. - Khi nồng độ auxin cao kích thích sự tạo mô sẹo dạng rời rạc nhưng khi giảm auxin thì mô sẹo có dạng nốt và cứng chắc. - Mô sẹo được tạo ra trong thí nghiệm có nhiều dạng cấu trúc khác nhau có thể là do mô phát triển trên môi trường nuôi cấy có 2,4-D là một auxin mạnh có tác dụng tốt cho quá trình phản biệt hóa. - Theo Gautheret (1966) khả năng tái sinh sẽ vẫn được duy trì lâu hơn ở mô sẹo rắn chắc và sẽ mất đi ở mô sẹo rời rạc, nguyên nhân có thể do mô sẹo mất khả năng tổng hợp một số chất chủ yếu cho sự tái sinh của nó khi số lần cấy chuyền tăng lên. - Tóm lại, kết quả thí nghiệm sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo rắn chắc tốt khi kết hợp nồng độ NAA 2 mg/l và 2,4-D (6 mg/l hay 7 mg/l) và khi nồng độ 2,4-D cao gây độc, có thể ức chế sự sinh trưởng của mô sẹo.. - mẫu tạo mô sẹo cứng chắc trong môi trường MS bổ sung 2,4-D kết hợp NAA vào thời điểm 8 tuần nuôi cấy. - Nghiệm thức 8 tuần sau khi cấy. - MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 5 mg/l 17,0 e. - MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 6 mg/l 29,0 cd MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l 27,8 cd MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 8 mg/l 23,3 de. - MS +NAA 5 mg/l +2,4-D 2 mg/l 36,1 bc. - MS +NAA 6 mg/l +2,4-D 2 mg/l 59,4 a. - MS +NAA 7 mg/l +2,4-D 2 mg/l 64,8 a. - MS +NAA 8 mg/l +2,4-D 2 mg/l 43,1 b. - 3.2 Hiệu quả của môi trường MS bổ sung 2,4-D, NAA và TDZ lên sự phát triển cụm mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào. - 3.2.1 Đường kính của mô sẹo. - Kết quả ở Bảng 3 cho thấy đường kính trung bình của cụm mô sẹo ở các nghiệm thức có sự khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% vào thời điểm 2 và 4 TSKC, trong đó nghiệm thức có đường kính trung bình thấp nhất là ở nghiệm thức đối chứng, 0,01 cm và nghiệm thức MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l, có đường kính trung bình cao nhất (lần lượt là 0,13 cm và 0,29 cm). - Ở thời điểm 6 và 8 TSKC nuôi cấy, đường kính trung bình của mô sẹo ở các nghiệm thức tiếp tục tăng. - Ở thời điểm này nghiệm thức MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l cho đường kính trung bình cao nhất (0,54 cm) và khác biệt có ý nghĩa thống kê 1% so với các nghiệm thức còn lại. - Đường kính trung bình của mô sẹo thấp vẫn là nghiệm thức đối chứng,. - Kết quả này phù hợp với nhận định của Gautheret (1966) cho rằng mô sẹo sau khi đã hình thành nếu được tiếp tục duy trì trên môi trường có auxin thì mô sẹo sẽ tăng sinh nhanh, nhưng nếu chuyển sang môi trường có đầy đủ thành phần dinh dưỡng không có sự hiện diện của auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo sẽ chậm lại.. - Bảng 3: Đường kính trung bình (cm) của mô sẹo trong môi trường bổ sung 2,4-D, NAA và TDZ theo thời gian. - Hình 1: Cụm mô sẹo có dạng cứng chắc màu xanh, với nhiều tế bào hình khối cầu (A) MS + NAA 2 mg/l + 2,4-D 7 mg/l (ở vật kính 20X). - Kết quả cũng cho thấy vào thời điểm 6 TSKC, mô sẹo có sự thay đổi về màu sắc và cấu trúc. - Ban đầu mô sẹo có màu vàng sáng, rắn chắc sau đó bắt đầu chuyển sang dạng khối cầu màu vàng xanh, xen lẫn với màu trắng sáng, bề mặt trơn láng (Hình 1), nhiều nhất ở nghiệm thức MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l +TDZ 0,04 mg/l, sau đó đến nghiệm thức NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l và nghiệm thức MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l +TDZ 0,08 mg/l, các nghiệm thức còn lại không có xuất hiện. - vào môi trường nuôi cấy các mô sẹo thì thu được cụm tiền chồi từ mô sẹo. - 3.2.2 Chiều cao của cụm mô sẹo. - Ở thời điểm 2 TSKC chiều cao trung bình của cụm mô sẹo ở các nghiệm thức không khác biệt về mặt thống kê (Bảng 4). - Tuy nhiên, sau 4 TSKC chiều cao trung bình của cụm mô sẹo bắt đầu có sự khác biệt thống kê ở mức 5%, đường kính trung bình cao nhất ở nghiệm thức MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l, 0,15 cm, khác biệt so với nghiệm thức đối chứng (0,0 cm) nhưng không khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. - Ở thời điểm 6 TSKC, nghiệm thức có chiều cao trung bình cao nhất vẫn là nghiệm thức MS + NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l, 0,25 cm, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với tất cả các nghiệm thức còn lại ngoại trừ nghiệm thức MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l +TDZ 0,04 mg/l, 0,19 cm.. - Bảng 4: Chiều cao (cm) của mô sẹo trong môi trường MS bổ sung 2,4-D, NAA và TDZ theo thời gian. - Tương tự, vào 8 TSKC sau khi cấy mô sẹo trên môi trường MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l, có đường kính trung bình cao nhất (0,32 cm) và khác biệt có ý nghĩa thống kê 1% so với nghiệm thức đối chứng, 0,0 cm, và nghiệm thức MS +NAA 2 mg/l +2,4-D 7 mg/l +TDZ 0,16 mg/l, 0,04 cm, nhưng không khác biệt so với các nghiệm thức còn lại.. - 3.3 Thí Nghiệm 3: Hiệu quả của môi trường MS bổ sung TDZ lên sự tạo phôi soma và tái sinh chồi của cụm mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào. - Kết quả thí nghiệm cho thấy, mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của thân chồi non tre Rồng in vitro có sự tạo phôi và hình thành chồi. - Nghiệm thức đối chứng (MS không bổ sung TDZ) không có chồi sự tái sinh (0%).. - Kết quả ở bảng 5 cũng cho thấy khi nồng độ TDZ tăng lên thì khả năng tái sinh chồi của cụm mô sẹo tre Rồng giảm xuống còn 5,67%, ở nồng độ này có thể TDZ đã gây độc cho mẫu cấy, một số mẫu đã bị biến. - Điều này chứng minh rằng, trên môi trường nuôi cấy không có cytokinin thì sự tái sinh chồi từ mô sẹo rất khó xảy ra nhưng khi nồng độ cytokinin (TDZ tăng lên 0,05 mg/l) thì tỷ lệ tái sinh chồi giảm có thể do cấu trúc của mô sẹo tạo ra từ các mẫu cấy ban đầu khác nhau do đó dẫn đến khả năng tái sinh chồi cũng khác nhau.. - Môi trường MS bổ sung NAA 2 mg/l kết hợp với 2,4-D 7 mg/l cho hiệu quả tạo mô sẹo cao (81,3%) và mô sẹo rắn chắc cao nhất (64,8%) ở thời điểm 8 tuần sau khi cấy.. - Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của mô sẹo là môi trường MS +NAA 2 mg/l kết hợp với 2,4-D 7 mg/l.. - Sự tạo phôi soma và tái sinh chồi cây tre Rồng từ mô sẹo trên môi trường MS bổ sung TDZ 0,01 mg/l đạt tỷ lệ 33,3% sau 3 tuần nuôi cấy.. - Tiến hành tạo rễ cho các cụm chồi tre Rồng có nguồn gốc từ mô sẹo để tạo cây hoàn chỉnh trong giai đoạn in vitro.