- TÁCH DÒNG cDNA VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỤ THỂ NEUROKININ-1 Võ Thị Thương Lan 1 , Lê Hồng Thu 1 , Đinh Đoàn Long 1,2. - Thụ thể neurokinin-1 (NK1-R) thuộc nhóm các thụ thể xuyên màng liên kết với G protein có vai trò quyết định hoạt động của các tế bào thần kinh, tham gia vào việc điều hòa các phản xạ nôn, hô hấp và các hành vi phản xạ. - Thụ thể NK1-R được phiên mã từ gen đơn bản nhưng gồm hai dạng sai khác nhau ở đầu carboxyl hình thành do cắt nối luân phiên mRNA. - Hai dạng NK1-R có ái lực liên kết khác nhau với các chất đồng vận hoặc các chất đối vận . - Biểu hiện NK1-R tái tổ hợp trong hệ thống tế bào động vật là phương pháp tối ưu hiện nay để sàng lọc các chất đối vận/đồng vận cạnh tranh với phối tử trong sản xuất các biệt dược điều trị các bệnh thần kinh, rối loạn đáp ứng miễn dịch. - Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập cDNA hoàn chỉnh mã cho NK1-R từ mô phổi của người Việt Nam. - Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của NK1-R phân lập từ mô phổi giống với NK1-R phân lập từ mô não của người Việt và có 4 amino acid sai khác so với trình tự gốc trong ngân hàng dữ liệu (Databank). - Tuy nhiên, phân tích in silico cho thấy 4 sai khác này không ảnh hưởng đến cấu trúc xuyên màng của thụ thể. - cDNA hoàn chỉnh được đưa vào vector biểu hiện pEGFP-N1 nhằm mục đích xây dựng hệ thống tế bào biểu hiện NK1-R tái tổ hợp để sàng lọc các chất đồng vận và đối vận thụ thể từ nguồn dược liệu Việt Nam.. - Từ khóa: Chất đối vận thụ thể, chất đồng vận thụ thể, phối tử P, thụ thể neurokinin-1 (NK1-R), thụ thể xuyên màng liên kết G protein.. - Thụ thể neurokinin-1 (NK1-R) là thành viên trong họ thụ thể chứa 7 vùng kỵ nước xuyên màng.. - Đầu carboxyl của NK1-R liên kết với G protein bên trong tế bào chất. - đầu amino liên kết chủ yếu với chất P (phối tử) ở bên ngoài màng tế bào (Severini et al., 2000). - Sau phiên mã, có 2 dạng mRNA (khác nhau ở vùng 3’) được dịch mã tổng hợp hai dạng NK1-R có ái lực khác nhau với các chất đồng vận hoặc các chất đối vận thụ thể (Jian et al., 2008). - Trong khi các chất đồng vận liên kết với thụ thể và có tác dụng tương tự như các phối tử (ligands) thì các chất đối vận liên kết với thụ thể nhưng không gây ra các phản ứng sinh học hoặc làm giảm hay khóa các phản ứng trung gian của chất đồng vận (Rosso, Mu˜noz, 2006). - Phát triển các thuốc đồng vận hay đối vận NK1-R đặc biệt có ý nghĩa đối với điều trị nhiều bệnh, ví dụ như thuốc giảm đau, chống lo âu, trầm cảm, chữa các bệnh đường hô hấp, điều trị chứng buồn nôn và sự nôn mửa do tác dụng của hóa trị liệu ung thư (Chamindi. - et al., 2009. - Một ứng dụng rộng rãi của thuốc đối vận NK1-R là tham gia vào việc điều trị chứng tâm thần phân liệt, trầm cảm có liên quan đến việc tăng lượng dopamine trong não bộ (Rupnipak, Kramer, 2002). - Khi phối tử P liên kết với NK1-R thì lượng dopamine tăng. - Có thể điều chỉnh lượng dopamine bằng cách sử dụng các thuốc đối vận liên kết với NK1-R nhằm ngăn chặn sự tương tác của chất P (Rupnipak, Kramer, 2002).. - Năm 2003, lần đầu tiên chất đối vận NK1-R là aprepitant (Emend) được hiệp hội quản lý thuốc và thực phẩm (FDA) Hoa Kỳ phê chuẩn cho phép sản xuất và lưu thông trên thị trường (Rogers, Blackburn, 2010).. - Việc tìm kiếm các chất đối vận hoặc đồng vận NK1-R hầu hết dựa vào hệ thống tế bào biểu hiện NK1-R nội sinh hoặc NK1-R tái tổ hợp (Quartara, Altamura, 2006). - Với ưu điểm nổi bật về số lượng và phương thức biểu hiện nên NK1-R tái tổ hợp được sử dụng trong các nghiên cứu cấu trúc, động học tương tác của NK1-R với chất đồng vận hoặc chủ vận (tăng khả năng phát hiện tương tác, chủ động gây đột biến định hướng làm thay đổi cấu trúc NK1- R. - Vì vậy, phân lập các cDNA hoàn chỉnh, biểu hiện NK1-R tái tổ hợp;. - từ đó thiết lập các hệ thống tế bào sàng lọc thuốc từ. - Ở Việt Nam, nghiên cứu về NK1-R, các chất đối vận hoặc đồng vận NK1-R vẫn còn rất ít hoặc chưa được công bố do hệ thống sàng lọc các chất này chưa khả thi. - Nghiên cứu này của chúng tôi trình bày kết quả phân lập cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể NK1 từ mô phổi, so sánh với cDNA phân lập từ mô não người Việt Nam và thiết kế vector biểu hiện mang cDNA-NK1-R hoàn chỉnh nhằm mục đích chủ động biểu hiện thụ thể này để sàng lọc các chất có khả năng tương tác với NK1-R từ dược liệu Việt Nam.. - Mẫu u phổi sau phẫu thuật được giữ ngay trong nitơ và được sử dụng để tách chiết ARN tổng số bằng PureLink Kit (Invitrogen). - Hai µg RNA tổng số được dùng làm khuôn trong phản ứng phiên mã ngược tổng hợp cDNA sử dụng oligoT và enzyme Reverse Transcriptase (Invitrogen). - Phản ứng RT-PCR được thực hiện để khuếch đại đoạn 5’-NK1 (788 bp) bằng cặp mồi NK1F:. - CGAAATGGATAACGTCCTCCC và NK1R 1 : GCCAGCAGATGGCGAAGG, và đoạn 3’-NK1. - (728 bp) bằng cặp mồi NK1F 1. - Phản ứng sử dụng 5 µl cDNA với chu trình nhiệt lặp lại 40 chu kỳ (94 o C 5 phút. - Sản phẩm sau đó được xử lý với enzyme SmaI và nối với nhau nhờ DNA ligase tạo nên cDNA hoàn chỉnh. - Vector pJET mang cDNA được kí hiệu là pJET-NK1. - Các phản ứng PCR đều sử dụng enzyme Pfu Taq polymerase có hoạt tính đọc sửa để đảm bảo tính chính xác trong quá trình nhân bản.Trình tự cDNA được xác định trên máy tự động.. - Mồi NK1F 3. - ATTTAAGCTTACCATGGATAACG TCCTCC (v ị trí nhận biết của HindIII được gạch chân và trình tự Kozak được in đậm) và mồi NK1R 3 : TAA GGATCC CTAGGAGAGCACATTG (vị trí nhận biết của BamHI) được thiết kế để nhân bản cDNA hoàn chỉnh của NK1-R từ khuôn pJET-NK1. - Sản phẩm PCR với cặp mồi NK1F 3 /R 3 được xử lý với hai enzyme HindIII và BamHI và đưa vào vector biểu hiện pEGFP-N1 đã được mở vòng với hai enzyme này.. - Vector pEGFP-NK1 được biến nạp vào E. - Trình tự nucleotide cDNA NK1-R hoàn chỉnh được xác định trên máy đọc tự động.. - KẾT QUẢ. - Phân lập hai đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA mã cho NK1-R. - Sử dụng khuôn là cDNAs để khuếch đại hai đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 bằng hai cặp mồi NK1F/NK1R 1 . - Kết quả, đoạn 5’-NK1 đã được khuếch đại thành một băng DNA rõ nét có kích thước gần 800 bp như tính toán (Hình 2A). - Hai đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 có kích thước hơn 700 bp được tinh sạch bằng Kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen), được tách dòng trong vector pJET1.2 (Fermentas) và được biến nạp vào tế bào khả biến E. - Sơ đồ phân lập cDNA thụ thể NK1 sử dụng các cặp mồi nhân bản vùng 5’-NK1 và vùng 3’-NK1 riêng biệt.. - kiểm tra khả năng mang gen của các vector tái tổ hợp tương ứng pJET-5-NK1 và pJET-3-NK1.. - Tạo cDNA hoàn chỉnh mã cho NK1-R. - Plasmid pJET-3-NK1 được mở vòng bởi SmaI và XbaI. - Sản phẩm PCR khuếch đại từ plasmid tái tổ hợp. - pJET-5-NK1 cũng được cắt với hai enzyme này và được đưa vào pJET-3-NK1 đã mở vòng để tạo thành đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho NK1-R (Hình 3A).. - Thể biến nạp E. - coli DH5α mọc trên môi trường kháng sinh có plasmid chứa cDNA hoàn chỉnh (Hình 3B).. - Plasmid tái tổ hợp được kí hiệu pJET-NK1.. - Xác định trình tự nucleotide cDNA hoàn chỉnh của NK1-R. - Plasmid pJET-NK1 được tách chiết từ dòng khuẩn lạc số 2 (Hình 3B) và được xác định trình tự trên máy đọc tự động. - So sánh trình tự cDNA nhận. - được từ mô phổi với trình tự cDNA hoàn chỉnh phân lập từ mô não người Việt Nam (Phan Ha Mỵ, 2012) không thấy bất kỳ sự sai khác nào. - Cả hai trình tự này đều có 5 nucleotide khác với trình tự trong ngân hàng dữ liệu (Mã số trên NCBI: M81797.1) tương ứng với sai khác của 4 amino acid (Bảng 1).. - Sai khác về trình tự nucleotide và amino acid giữa thụ thể NK1 của người Việt với trình tự trên NCBI. - Các số trong ngoặc chỉ vị trí của các nucleotide hoặc các amino acid trong trình tự gốc có trong ngân hàng Databank. - cDNA-NK1-R (Người Việt Nam). - Điện di sản phẩm PCR phân lập đoạn 5’-NK1 (A) và 3’-NK1 (B. - Giếng NK1: cDNA hoàn chỉnh của NK1. - (A) Plasmid pJET-3-NK1 (p3’) và sản phẩm PCR (5’) được xử lý với hai enzyme SmaI và XbaI. - (B) Các khuẩn lạc (1-4) mang cDNA hoàn chỉnh (~1.4 kb) sàng lọc bằng colony-PCR. - Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA hoàn chỉnh của NK1-R. - Đoạn cDNA hoàn chỉnh được khuếch đại từ plasmid pJET-NK1 với cặp mồi NK1F 3 /R 3 (Hình 4A) và được cắt với hai enzyme HindIII và BamHI. - Việc thiết kế thêm trình tự Kozak (ACCATGG) trong mồi NK1F 3 cho phép sử dụng mã mở đầu trong trình tự. - cDNA của NK1 thay vì mã mở đầu được thiết kế sẵn trên vector biểu hiện. - Do đó kích thước cDNA hoàn chỉnh giảm đi 100 bp ở vùng 5’ không dịch mã. - cDNA hoàn chỉnh mã cho NK1-R được đưa vào vector mở vòng nhờ DNA ligase. - Các thể biến nạp mang vector biểu hiện có chứa cDNA được chọn lọc bằng phản ứng PCR (Hình 4B).. - Giải trình tự cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho NK1- R trong vector biểu hiện pEGFP-N1. - Để khẳng định sự có mặt của cDNA-NK1 trong các vector biểu hiện, hai vector biểu hiện pCDNA3- NK1-11 và peGFP-N1-NK1-5 được giải trình tự (kết quả không hiển thị). - Kết quả giải trình tự cho thấy cDNA-NK1 trong vector biểu hiện không có bất kỳ sự sai khác nào so với trình tự cDNA gốc trong vector tách dòng pJET. - Điều đó chứng tỏ rằng chúng tôi đã thành công trong việc thiết kế vector biểu hiện mang cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho NK1-R ở người Việt Nam.. - NK1-R là một trong ba loại thụ thể của tachykinin ở động vật có vú. - Trên thực tế, liên kết chéo có thể xảy ra nhưng với ái lực liên kết rất khác nhau giữa các thụ thể và tachykinin (Almeida et al., 2004). - Ví dụ như tachykinin P có ái lực liên kết với NK1-R cao gấp 100 và 500 lần so với hai thụ thể khác (Gerard et al., 1991). - Phân tử mRNA phiên mã từ gen NK1-R được cắt nối luân phiên tương ứng với loại NK1 mang chiều dài hoàn chỉnh (407 amino acid) và loại NK1 bị xén cụt đầu carboxyl (311 amino acid) (Caberlotto et al., 2007). - Biểu hiện. - của dạng ngắn không được phát hiện khi phân lập cDNA của NK1-R từ mô não người Việt, gợi ý sự hoạt động khác nhau của NK1-R ở các mô biệt hóa (Baker et al., 2003).. - Trình tự nucleotide cDNAs hoàn chỉnh mã hóa cho NK1-R của người lần đầu tiên được công bố bởi Hopkins và đồng tác giả (1991). - Kết quả của chúng tôi cho thấy NK1-R mô phổi giống với NK1-R mô não người Việt và đều có 4 amino acid sai khác với số liệu trong Databank. - Điều này chứng tỏ rằng sự khác biệt giữa trình tự nucleotide trong gen mã hóa cho NK1-R của người Việt Nam với trình tự nucleotide trong ngân hàng dữ liệu rất có thể là do tính đa hình nucleotide (SNPs). - Sử dụng phần mềm TMHMM server 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/. - services/TMHMM-2.0/) để kiểm tra tính xuyên màng của trình tự protein suy diễn thu được, chúng tôi nhận thấy cả 4 sai khác amino acid không ảnh hưởng đến tính xuyên màng. - Tuy nhiên, chỉ một amino acid sai khác cũng đủ làm thay đổi ái lực liên kết với phối tử (Ciucci et al., 1997). - Trình tự amino acid của NK1 ở người và chuột có độ tương đồng cao 99%, tuy nhiên ái lực liên kết với cùng phối tử L-733060 thay đổi từ 0.87 với NK1-R của người đến 550 với NK1-R chuột (Almeida et al., 2004). - Vì vậy, việc thiết kế thành công vector biểu hiện NK1-R của người Việt Nam khẳng định mối liên hệ giữa sai khác 4 amino acid và ái lực kiên kết, đồng thời mở ra khả năng sử dụng hệ thống tế bào để sàng lọc các Hình 4. - (A) Plasmid pJET-3-NK1 (pC) và sản phẩm PCR (NK1) được xử lý với hai enzyme SmaI và XbaI. - (B) Các khuẩn lạc (1-6) mang cDNA hoàn chỉnh (1241 bp) được sàng lọc bằng colony-PCR. - chất đối vận, đồng vận với NK1-R từ nguồn dược liệu phong phú đa dạng của nước ta.. - Chúng tôi đã thiết kế được vector biểu hiện pEGFP-N1 mang cDNA hoàn chỉnh của NK1-R phân lập từ mô phổi người Việt Nam. - Trình tự amino acid suy diễn giống với NK1-R phân lập từ mô não người Việt và có 4 sai khác so với trình tự gốc trong Databank. - Phân tích mô phỏng cho thấy sự sai khác này không ảnh hưởng đến tính xuyên màng của thụ thể, tuy nhiên ái lực kiên kết với phối tử cần nghiên cứu tiếp trên hệ thống tế bào biểu hiện NK1-R tái tổ hợp.. - Lời cảm ơn: Chúng tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam cho đề tài ĐT-PTNTĐ 2011-G/04 để thực hiện nghiên cứu này.. - Phan Hà Mỵ (2012) Tách dòng cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin 1 từ mô não người Việt Nam