Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người Việt Nam

- Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người Việt Nam.
- thụ thể họ tachykinin và thụ thể neurokinin-1.
- ứng dụng của thụ thể neurokinin-1 trong điều trị bệnh.
- vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction).
- Đưa ra kết quả và thảo luận: Tách dòng gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ phổi người.
- thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1..
- Gen mã hóa.
- Thụ thể neurokinin-1.
- Thụ thể neurokinin – 1 thuộc nhóm các thụ thể xuyên màng liên kết với G protein.
- Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của thụ thể neurokinin-1, các hãng dược phẩm đã cố gắng tìm ra các chất đối vận với thụ thể neurokinin-1 nhằm sản xuất thuốc giảm đau cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho các bệnh nhân ung thư.
- Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về thụ thể này ở người Việt Nam còn rất ít hoặc chưa được công bố.
- Chính vì vậy, với mục đích phân lập được đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể này ở người Việt Nam và biểu hiện chúng trên hệ thống tế bào động vật để có.
- thể chủ động được nguồn gen và các hệ thống sàng lọc thuốc từ nguồn dược liệu Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam”.
- G protein định vị ở mặt trong màng tế bào và được hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) phân bố trên bề mặt màng tế bào..
- Thụ thể liên kết với G protein.
- Họ thụ thể liên kết với G protein là những phân tử protein kích thước nhỏ (350-500 acid amine) [45], được phân thành các phân họ khác nhau dựa theo độ tương đồng về trình tự acid amine, chức năng và khả năng liên kết với các cấu tử.
- Đến nay đã người ta đã phát hiện ra 367 thụ thể liên kết với G protein ở người, trong đó có khoảng 150 GPCRs được tìm thấy vẫn chưa biết chức năng [52]..
- Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin.
- Thụ thể của họ tachykinin (TACR) thuộc lớp A trong họ thụ thể liên kết với G protein (Hình 1)..
- Tương tự như thụ thể rhodopsin, TACR có cấu trúc gồm 7 vùng xuyên màng đặc trưng được nối với nhau bởi các vòng phía ngoài và phía trong màng sinh chất (exoloop và cytoloop).
- Những vòng ở phía ngoài màng tế bào của thụ thể liên kết với G protein có chức năng lựa chọn cấu tử gắn đặc hiệu trong khi các vùng xuyên màng có chức năng quyết định hoạt tính của thụ thể..
- 1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH Từ những hiểu biết về chức năng của thụ thể neurokinin 1 hứa hẹn đây sẽ là đích tác động hiệu quả cho các phương pháp điều trị một số căn bệnh có liên quan.
- Tuy đến nay các nghiên cứu về chất đối vận với thụ thể tachykinin vẫn chưa đạt được kết quả như mong đợi và gặp rất nhiều khó khăn, nhưng việc sử dụng thụ thể NK1 làm đích tác động của thuốc vẫn là một bài tóan hay và khó cho nhiều nhà nghiên cứu.
- Gen mã hóa cho thụ thể liên kết với G protein được dung hợp vào nhiều hệ vector và nhiều dòng tế bào khác nhau.
- Tuy nhiên, do thụ thể liên kết với G protein thường được biến đổi sau dịch mã bằng cách gắn thêm carbonhydrate hoặc lipid hóa… nên việc biểu hiện trên hệ thống tế bào nhân sơ thường không cho kết quả như mong muốn..
- Một nghiên cứu gần đây năm 2006 của Farahdiba và cộng sự khi nghiên cứu truyền tin của thụ thể β-arrestin 1 đã tiến hành dung hợp gen mã hóa cho thụ thể này với gen mã hóa cho NK1 và biểu hiện chúng trong hai hệ vector pCDNA3.1 và pEGFP-N1 cũng cho kết quả tốt.
- Khuếch đại đoạn 3’-NK1 Khuếch đại đoạn 5’-NK1.
- Tách dòng đoạn 5’-NK1 Tách dòng đoạn 3’-NK1.
- Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin – 1 ở phổi người Việt Nam..
- Khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- Đoạn cDNA mã hóa cho thụ thể NK1 sẽ được tách dòng thành hai đoạn: đoạn 5’-NK1 và đoạn 3’-NK1.
- Hình 6: Sơ đồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 của gen mã hóa cho neurokinin-1.
- Bảng 10: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- Đoạn 5’–NK1 (788 bp).
- Đoạn 3’- NK1 (728 bp).
- Đây là kích thước đúng với tính toán cho đoạn 5’-NK1..
- Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- Giếng 5’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1.
- Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) để chuẩn bị cho phản ứng tách dòng đoạn 5’-NK1 của cDNA..
- Khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- Tương tự như đối với đoạn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng cDNA làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R để khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- Hình 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1.
- Sau đó, cDNA này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 bằng cặp mồi đặc hiệu NK1 F1/ NK1 R.
- Bảng 11: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- đoạn 3’–NK1.
- Sử dụng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) chúng tôi tinh sạch đoạn 3’-NK1..
- Hình 9: Điện di sản phẩm PCR dùng khuôn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch đại đoạn 3’-NK1.
- Tách dòng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Sau khi đã tinh sạch, từng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 được đưa vào vector pJET1.2 bằng phản ứng nối sử dụng kit Gene JET TM PCR Cloning Kit (Fermentas).
- Bảng 12: Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 (hoặc 3’-NK1) của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vào vector pJET1.2.
- Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện Đoạn 5’-NK1.
- (hoặc đoạn 3’NK1) 8.0.
- Bảng 13: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- Kết quả cho thấy 7 trong 8 khuẩn lạc đều cho một băng DNA có kích thước phù hợp với đoạn 5’-NK1.
- Như vậy, chúng tôi đã tách dòng được đoạn 5’ –NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- Chúng tôi kí hiệu bảy khuẩn lạc này lần lượt từ 5’-NK1-1 đến 5’-NK1-7..
- Tương tự như sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn 5’–NK1, chúng tôi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn 3’-NK1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R.
- Bảng 14: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- Kết quả cho thấy 5 trong 8 khuẩn lạc (số đều cho một băng DNA có kích thước phù hợp với đoạn 3’-NK1.
- Như vậy, chúng tôi đã tách dòng thành công đoạn 3’–NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- Chúng tôi kí hiệu năm khuẩn lạc này là 3’-NK1-1 đến 3’-NK1-5..
- Hình 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 bằng cặp mồi NK1 F1/ NK1 R.
- Tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1.
- Quá trình tách dòng cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 được trình bày trong Hình 12..
- Sơ đồ tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1..
- Đầu tiên chúng tôi chọn khuẩn lạc 5’-NK1-2 và 3’-NK1-6 để tách chiết các plasmid tái tổ hợp mang đoạn chèn tương ứng 5’-NK1 và 3’-NK1.
- Plasmid này được kí hiệu p5’-NK1-2 và p3’- NK1-6.
- Sử dụng p5’-NK1-2 làm khuôn cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn 5’-NK1 với mồi.
- Bảng 15: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại 5’-NK1 trong vector tái tổ hợp p5’-NK1-2 bằng cặp mồi NK1 R1/ pJET R.
- p5’-NK1-2 1.0.
- Kết quả cho thấy chúng tôi đã khuếch đại thành công đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi NK1 R1/pJET R..
- Hình 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi pJET R/ NK1 R.
- Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) và được cắt bởi hai enzyme XbaI/SmaI để chuẩn bị cho việc ghép nối với đoạn 3’-NK1.
- Tiếp theo, chúng tôi cũng tiến hành cắt vector tái tổ hợp p3’-NK1-6 với hai enzyme XbaI/ SmaI.
- p3’-NK1-2 (hoặc sản phẩm.
- PCR đoạn 5’-NK1) 8.0.
- Băng DNA có kích thước 700 bp của đoạn 5’-NK1 và băng DNA có kích thước 3341 bp gồm plasmid pJET và đoạn 3’-NK1 được tinh sạch bằng kit của QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) rồi điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8% (Hình 14B).
- 1: sản phẩm PCR chứa đoạn 5’-NK1 sau khi cắt.
- 2: sản phẩm vector p3’-NK1-6 cắt.
- Đoạn 5’-NK1 và vector có chứa đoạn 3’-NK1 được nối với nhau theo thành phần trình bày trong Bảng 17..
- Bảng 17:Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 vào vector pJET1.2-3’-NK1 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện.
- Ủ 16 0 C qua đêm 5’-NK1 5.0.
- p3’-NK1-6 4.0 T4 ligase 1.0 Tổng 20.0.
- Đây là hai mồi bắt cặp với trình tự ở đầu 5’ và đầu 3’ của cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1.
- Bảng 18: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc chứa đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- Giải trình tự cDNA hòan chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- Kết quả khi so sánh với trình tự nucleotide của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 được tách dòng từ não người Việt Nam, chúng tôi không thấy bất kỳ sự sai khác nào.
- Điều này chứng tỏ rằng sự khác biệt giữa trình tự nucleotide trong gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 của người Việt Nam với trình tự nucleotide trong ngân hàng dữ liệu là do tính đa hình của gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người..
- Như vậy, từ kết quả giải trình tự cho thấy chúng tôi đã tách dòng thành công cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mẫu phổi người Việt Nam..
- Để biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người, chúng tôi sử dụng hai vector biểu hiện ở tế bào động vật là pCDNA3 và pEGFP-N1.
- Khi lựa chọn enzyme cắt giới hạn, chúng tôi không thấy enzyme nào trong vị trí đa điểm của vector pEGFP-N1 và pCDNA3 thỏa mãn điều kiện cắt văng ra đoạn cDNA hoàn chỉnh từ vector tái tổ hợp pJET1.2-NK1.
- Như vậy cặp mồi mới thiết kế đã cho phép nhân đặc hiệu đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
- Tách dòng vector biểu hiện mang cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin -1.
- Bảng 22: Thành phần và điều kiện của phản ứng nối cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vào vector pCDNA3 và pEGFP-N1.
- Giải trình tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 trong vector biểu hiện.
- Điều đó chứng tỏ rằng chúng tôi đã thành công trong viê ̣c thiết kế vector bi ểu hiện mang cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người Việt Nam.
- Tách dòng thành công cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin – 1 ở phổi người Việt Nam.
- 641, 996) không giống với trình tự cDNA-NK1 trong ngân hang dữ liệu, chứng tỏ sự đa hình của gen mã cho thụ thể NK1 ở người Việt Nam..
- Thiết kế thành công vector biểu hiện pCDNA3 và pEGFP-N1 mang cDNA mã cho thụ thể NK1 phân lập từ phổi của người Việt Nam.