- The appropriate concentration of ammonium sulfate and temperature for bromelain precipitation were 80% (v/v) and 27 o C, respectively. - Trên thế giới nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành chiết tách, tinh sạch bromelain từ phế phụ phẩm bằng nhiều cách khác nhau như kết tủa bằng amôn sulfat, sắc k trao đổi ion, đông khô, sấy phun (Devakate et al., 2009. - Do vậy, mục tiêu của nghiên cứu là xây dựng quy trình trích ly và bảo quản bột enzyme bromelain thô cho quá trình sử dụng. - Kết tủa dịch trích với các tác nhân tủa acetone (tinh khiết), ethanol (99,8. - ammonium sulfate (70. - NH 4 ) 2 SO 4 với nồng độ 70% bão hòa (472 g (NH 4 ) 2 SO 4 trong 1 lít dịch trích) (Nguyễn Đình Huyên và tv., 1994).. - Đặt ở nhiệt độ -20 o C trong 30 phút và ly tâm thu kết tủa và sấy khô tủa. - Tương tự phần 2, phần 3 (250 ml) sau khi được làm lạnh đến nhiệt độ (0-4 o C) thêm 4 thể tích ethanol (-20 o C) vào khuấy đều, để ở nhiệt độ -20 o C trong 2 giờ. - Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố là nồng độ ammonium sulfate (S ) 60, 70, và 80% và nhiệt độ kết tủa là 27 và 4 o C.. - Bột bromelain thô được trích ly bằng cách kết tủa với ammonium sulfate 80% bão hòa ở 27 o C, thời gian cho muối vào 45 phút. - á ỉ t êu t dõ : Lượng enzyme bromelain thô thu được (g) (sử dụng cân điện tử độ chính xác 0.0001), hoạt tính của enzyme. - bromelain bằng phương pháp Kunitz (1974) cải tiến, xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976) và tính hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme bromelain. - So sánh hiệu quả kinh tế của các tác nhân kết tủa và phương pháp sấy.. - 3.1 Ảnh hƣởng của các tác nhân kết tủa đến kết quả thu nhận bromelain thô từ chồi ngọn. - Enzyme bromelain thô được trích ly từ phần chồi ngọn của trái khóm bằng phương pháp kết tủa với tác nhân tủa thích hợp, nhằm chọn tác nhân tủa đơn giản, không độc hại và chi phí thấp. - Các kết quả thu nhận enzyme bromelain thô từ các tác nhân kết tủa khác nhau được trình bày ở Bảng 1. - Hoạt tính enzyme thu hồi được sau khi sấy khô của từng tác nhân tủa mang lại không giống nhau.. - Kết quả thể hiện cho thấy hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme khi tủa bằng acetone đạt cao nhất (82,86%) so với ethanol (79,19%) và amonium sulfate (66,52. - (2009) thì 80% hoạt tính enzyme và 34%. - protein thu hồi được khi kết tủa phân đoạn bromelain trái với phân đoạn 40-60% (w/v) ammonium sulfate ở nhiệt độ 4 o C. - Với phương pháp tủa phân đoạn có thể loại bỏ được phần protein tạp có trong dung dịch khóm do nồng độ ammonium sulfate thấp thì chỉ có một phần protein bị kết tủa. - Mặt khác, nhiệt độ lạnh cũng có thể hạn chế được sự mất hoạt tính của bromelain khi kết tủa nên hiệu suất thu hồi hoạt tính của quá trình này khá cao.. - Bảng 1: Ảnh hƣởng của tác nhân tủa đến quá trình trích ly enzyme bromelain Tác nhân tủa HSTH hoạt tính. - Hoạt tính riêng (U/mg). - Khối lƣợng bột enzyme (g). - 20000 TU (VNĐ) Ammonium sulfate (SA . - Hoạt tính riêng của enzyme do tác nhân tủa là dung môi hữu cơ (acetone và ethanol) cao hơn so với ammonium sulfate. - Sự khác biệt này có thể do ở nhiệt độ thấp, sự kết hợp giữa dung môi hữu cơ và các phân tử nước trong enzyme làm tăng lực hút giữa các enzyme, các enzyme kết hợp lại với nhau có thể làm ổn định cấu trúc của chúng. - (1967) nhiều dung môi hữu cơ như acetone và ethanol đã được sử dụng cho việc kết tủa bromelain. - Mặt khác, dung môi hữu cơ sau khi kết tủa các protein có trong dung dịch, chúng bị đuổi ra khỏi tủa dễ dàng khi sấy do nhiệt độ bốc hơi của dung môi thấp, với ammonium sulfate chúng vẫn còn lẫn trong bột enzyme sau khi sấy và với sự hiện diện của ammonium sulfate trong chế phẩm gây ảnh hưởng đến khả năng thủy phân casein của bromelain.. - Khối lượng bột enzyme bromelain thô thu được khi tủa bằng ammonium sulfate cao hơn khi tủa bằng acetone và ethanol, mặc dù cả ba tác nhân tủa được tiến hành với một lượng dịch trích ban đầu như nhau. - Điều này là phù hợp bởi vì trong bột enzyme còn có sự hiện diện của muối ammonium sulfate, tuy nhiên hoạt tính riêng của enzyme bromelain thô thu được khi tủa bằng ammonium sulfate (11,90 U/mg) gần tuơng đương với bột enzyme tủa bằng ethanol (13,16 U mg) và acetone (14,15 U/mg). - Với tác nhân tủa là acetone và ethanol khi cho vào dung dịch có protein chúng làm giảm hằng số lưỡng điện, đồng thời làm tăng lực hấp dẫn giữa các phân tử protein có điện tích trái dấu và do đó gây ra kết tủa protein. - cũng có thể hòa tan các protein trong những điều kiện thích hợp nên có thể làm giảm lượng tủa thu được cũng như là làm giảm khối lượng bột enzyme thô thu được. - Trong khi đó muối ammonium sulfate ở nồng độ cao gây kết tủa protein rất tốt.. - Tủa bằng ammonium sulfate dễ tiến hành hơn vì thao tác đơn giản và có thể thực hiện ngay ở nhiệt độ phòng. - Theo Đặng Thị Thu (2004) khi sử dụng dung môi hữu cơ để kết tủa bromelain thì phải tiến hành nhanh ở nhiệt độ lạnh để hạn chế sự mất hoạt tính của protein. - Heinicker và Gotner (1957) cũng báo cáo khi dùng acetone để kết tủa bromelain thân và trái thì làm lạnh dịch trích đến nhiệt độ khoảng 0-4 o C, còn acetone tinh khiết thì được giữ lạnh -20 o C. - Ngoài ra, tủa bằng dung môi hữu cơ thì tổng thể tích của dịch trích sau khi cho dung môi vào tăng lên rất nhiều so với lượng dịch trích ban đầu (tủa bằng acetone thể tích tăng lên 3 lần so với lượng dịch trích ban đầu, còn với ethanol thể tích tăng lên 5 lần), điều này gây khó khăn trong quá trình lấy tủa ra khỏi dung dịch đặc biệt là khi cần tiến hành kết tủa với quy mô lớn.. - Tính toán chi phí để sản xuất ra cùng một lượng đơn vị hoạt tính protease như nhau với các tác nhân kết tủa khác nhau cũng được thực hiện. - Về khía cạnh kinh tế, rõ ràng khi tủa bằng dung môi hữu cơ chi phí cao hơn tủa bằng ammonium sulfate (tác nhân tủa là acetone chi phí cao gấp 1,95 lần so với tủa bằng ammonium sulfate, ethanol thì cao gấp. - Với những kết quả nhận được ở trên có thể thấy rằng sử dụng ammonium sulfate để kết tủa thu bromelain thô từ phần chồi ngọn của trái khóm với quy mô công nghiệp có ưu điểm hơn vì phương pháp này thực hiện đơn giản, không độc hại và chi phí thấp hơn nhiều so với hai tác nhân tủa còn lại.. - 3.2 Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium sulfate và nhiệt độ kết tủa đến hoạt tính của enzyme bromelain thô. - mmonium sulfate (S ) có thể kết tủa hoàn toàn các protein hoà tan có trong dung dịch. - Tuy nhiên, tùy từng loại protein mà chúng có thể bị kết tủa ở những nồng độ ammonium sulfate khác nhau trong đó có bromelain. - Hiệu quả của các nồng độ ammonium sulfate (từ 60 - 80%) và nhiệt độ kết tủa (4 o C và 27 o C) đến hoạt tính và hàm lượng protein của bột enzyme được thể hiện ở Hình 2.. - Như đã đề cập, nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình trích ly bromelain, đặc biệt khi sử dụng tác nhân kết tủa acetone và ethanol. - Tuy nhiên, khi kết tủa bromelain bằng ammonium sulfate thì nhiệt độ khi kết tủa cũng ảnh hưởng đến khả năng duy trì hoạt tính và hàm lượng protein trong dung dịch. - Kết quả thu nhận được cho thấy khi kết tủa dịch chồi ngọn bằng ammonium sulfate ở nhiệt độ 4 o C thì hoạt tính enzyme và hàm lượng protein được duy trì luôn luôn tốt hơn nhiệt độ 27 o C ở bất kỳ nồng độ muối nào, do ở nhiệt độ lạnh (4 o C) thì quá trình kết tủa protein và khả năng hạn chế sự biến tính diễn ra tốt hơn. - (1994) khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ kết tủa đến quá trình trích ly bromelain từ trái khóm bằng ammonium sulfate cũng đã khẳng định rằng hoạt tính của chế phẩm trích ly ở nhiệt độ 4 o C thường cao hơn ở nhiệt độ 27 o C.. - Đồng thời kết quả (Hình 2) cũng chỉ ra rằng khi nồng độ muối càng cao thì hiệu suất thu hồi hoạt tính và hiệu suất thu hồi hàm lượng protein càng cao. - Ở nồng độ 80% ammonium sulfate cho kết quả thu hồi hoạt tính enzyme và. - hàm lượng protein tốt nhất ở cả hai mức nhiệt độ là 4 o C và 27 o C và kết quả đạt cao nhất tại nồng độ 80% muối ở nhiệt độ 4 o C. - Tuy nhiên, qua thực nghiệm cho thấy quá trình kết tủa ở nhiệt độ 4 o C khó thực hiện vì phải thiết kế và đầu tư phòng lạnh 4 o C và phải có trang thiết bị ổn định nhiệt độ môi trường ở 4 o C nên rất tốn kém.. - Hình 2: Hiệu suất thu hồi hoạt tính và hàm lƣợng protein khi kết tủa ở những nồng độ ammonium sulfate và nhiệt độ khác nhau G : N ệm thức 1: 60% S và 27 o C. - Hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme khi tủa bằng ammonium sulfate ở nồng độ 80% bão hòa và nhiệt độ 27 o C cho kết quả không có sự khác biệt ngh a với các mẫu kết tủa ở nhiệt độ 4 o C ở nồng độ 60 và 70% muối và là giá trị tốt nhất khi kết tủa ở nhiệt độ phòng (27 o C).. - (1994), khi kết tủa bromelain trái bằng ammonium sulfate ở các nồng độ từ 30 đến 100% đã kết luận rằng ở nồng độ 70%. - ammonium sulfate cho hiệu suất thu hồi hoạt tính cao nhất. - Sự khác biệt kết quả này có thể do trong chồi ngọn trái khóm có chứa hàm lượng protein cao gấp nhiều lần so với các bộ phận khác trong trái khóm, vì vậy ở nồng độ muối thấp hơn 80% khả năng làm kết tủa toàn bộ protein có trong dung dịch chưa diễn ra hoàn toàn, ở nồng độ 80% hầu hết các protein đều bị kết tủa, trong đó có bromelain.. - Khảo sát hoạt tính riêng của bột enzyme thu được khi kết tủa bromelain ở những nồng. - độ ammonium sulfate và nhiệt độ khác nhau kết quả thể hiện ở Hình 3 cho thấy hoạt tính riêng của mẫu kết tủa ở nồng độ 60%. - ammonium sulfate cao hơn các mẫu được kết tủa với các nồng độ muối còn lại ở cả nhiệt độ 27 và 4 o C. - Điều này có thể giải thích do ở nồng độ 60% muối thì phần lớn protein có trong dung dịch bị kết tủa là bromelain. - Khi tăng nồng độ muối thì hàm lượng protein tạp bị kết tủa sẽ tăng nên làm giảm hoạt tính riêng của mẫu. - Hoạt tính riêng của mẫu bromelain kết tủa ở nhiệt độ 4 o C cao hơn các mẫu kết tủa ở nhiệt độ 27 o C. - Nhiệt độ càng cao thì khả năng phá vỡ các liên kết trong cấu tử của enzyme càng nhiều, sự phá vỡ cấu trúc không gian của enzyme càng mạnh và làm tăng sự mất hoạt tính của enzyme. - (1994) cho rằng sự kết tủa bromelain bằng ammonium sulfate ở nhiệt độ thấp là quá trình hoàn toàn thuận nghịch và có thể hạn chế tối đa sự mất hoạt tính của enzyme nhưng nhìn chung kết tủa ở nhiệt độ 27 o C cũng không làm giảm đáng kể hoạt tính của enzyme bromelain.. - Hình 3: Hoạt tính riêng enzyme khi kết tủa ở những nồng độ SA và nhiệt độ khác nhau Nghiệm thứ 1: 60% S và 27 o C . - Khối lượng bột enzyme thu được khi tủa với SA ở các nồng độ và nhiệt độ khác nhau thể hiện ở Hình 4.. - Hình 4: Khối lƣợng bột enzyme thu đƣợc khi kết tủa ở các nồng độ chất tủa và nhiệt độ. - Khối lượng của bột enzyme thu được càng nhiều khi mẫu được kết tủa với nồng độ ammonium sulfate càng cao do muối ammonium sulfate ở nồng độ cao tác dụng gây kết tủa protein của chúng tăng lên. - Theo báo cáo của Dixon và Webb (1975) thì trong dịch trích thô của enzyme vẫn còn chứa nhiều protein khác có trọng lượng phân tử khác nhau, những thành phần này có thể được tách ra bằng cách kết tủa với ammonium sulfate ở những phân đoạn khác nhau. - Khối lượng bột enzyme thu được khi kết tủa ở nhiệt độ 4 o C nhiều hơn khi kết tủa ở nhiệt độ 27 o C do ở nhiệt độ 27 o C khả năng bị biến tính của enzyme vẫn diễn ra làm ảnh hưởng đến hàm lượng protein có trong mẫu.. - 3.3 Ảnh hƣởng của phƣơng pháp sấy đến hoạt tính bột enzyme bromelain thô Nhiệt độ và thời gian sấy là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của chế phẩm enzyme thô. - Sấy ở nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzyme do protein bị biến tính.. - Tuy nhiên, khi sấy ở nhiệt độ thấp thì thời gian sấy kéo dài và trong thời gian này với sự hiện diện của ẩm độ cao thì sự tự phân của các protease sẽ diễn ra làm giảm hoạt tính của enzyme. - Kết quả cũng cho thấy có sự khác biệt ngh a về hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme giữa các mẫu sấy bằng phương pháp khác. - Khối lượng bột enzyme (g). - Bảng 2: Ảnh hƣởng của phƣơng pháp sấy đến chất lƣợng, khối lƣợng và thời gian sấy bột enzyme bromelain thô. - Phƣơng pháp sấy Hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme. - Hoạt tính riêng của enzyme (U/mg). - Đông khô . - Phương pháp sấy đông khô trong 15 giờ hoạt tính enzyme duy trì được 85,73% so với ban đầu và hoạt tính riêng của bột enzyme đạt 11,96 (U/mg). - Sấy chân không ở 35 o C trong 9 giờ thu được 74,74% hoạt tính so với ban đầu và hoạt tính riêng của bột đạt 10,07 (U/mg). - Như vậy, hoạt tính của bromelain ổn định hơn khi sấy đông khô do sấy đông khô nhiệt độ của quá trình sấy thấp (-40 o C) nên protein duy trì được cấu trúc và hình thái trong suốt quá trình tách nước. - (2009) so sánh hiệu quả của sấy phun và sấy đông khô bromelain sau khi tinh sạch kết quả đã thu được 95% hoạt tính được giữ lại sau quá trình sấy đông khô và 78,2% đối với sấy phun.. - So với sấy đông khô thì sấy chân không được tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiều (35 o C) nên hoạt tính của bromelain sau khi sấy thấp hơn nhưng so với phương pháp sấy bằng H 2 SO 4 ở nhiệt độ 4 o C thì kết quả khác biệt không ngh a ở mức độ thống kê 5%. - Khối lượng bột enzyme thu được sau quá trình sấy đông khô ít hơn khi sấy chân không và sấy bằng H 2 SO 4 . - Sau khi sấy đông khô bột enzyme có độ ẩm 4,87% căn bản ướt thấp hơn rất nhiều so với sấy chân không sản phẩm có độ ẩm 7,9%, sấy bằng H 2 SO 4 độ ẩm của sản phẩm cuối đạt 6,80%. - Để thực hiện quá trình sấy bột enzyme đến độ ẩm bảo quản an toàn (<8. - Khảo sát hoạt tính thủy giải của bột enzyme thành phẩm và bột enzyme thương mại của Merck (Bảng 3) cho thấy hoạt tính tổng trong 1 g bột enzyme thành phẩm thấp hơn bột enzyme thương mại (Merck) nhưng hoạt tính riêng của enzyme thành phẩm cao hơn enzyme thương mại. - Bảng 3: So sánh bột enzyme bromelain thành phẩm và bột enzyme thƣơng mại. - Loại bromelain Hoạt tính trong 1 g. - Hoạt tính riêng (TU/mg protein). - Kết tủa bromelain chồi ngọn bằng acetone cho kết quả 82,86% hoạt tính enzyme được thu hồi. - Kết tủa bằng ethanol 79,19% hoạt tính được duy trì so với ban đầu. - Kết tủa bằng ammonium sulfate hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme đạt 66,19%.. - Nồng độ ammonium sulfate và nhiệt độ kết tủa dịch chồi ngọn thích hợp là 80% (w v) bão hòa và 27 o C.. - Thời gian cho ammonium sulfate vào dịch trích là 45 phút cho kết quả duy trì hoạt tính và hoạt tính riêng cao nhất.. - 8%, hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme đạt 74,74%.