- TẠO CÂY DƯA HẤU TỨ BỘI BẰNG XỬ LÝ COLCHICINE IN VITRO. - Dưa hấu không hạt được tạo thành do lai giữa cây dưa hấu tứ bội (4X=44) làm mẹ và cây nhị bội (2X=22) làm cha.. - Trong tự nhiên, cây dưa hấu tứ bội không hiện diện. - Thông thường, cây tứ bội được phát triển bởi xử lý đột biến cây con nhị bội trong điều kiện vườn ươm hoặc nuôi cấy mô. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm phát triển những dòng dưa hấu tứ bội để tạo giống dưa hấu tam bội. - Kết quả nghiên cứu cho thấy xử lý colchicine nồng độ 0,025% trong thời gian 6 ngày cho tỷ lệ cây tứ bội cao nhất là 10%. - Từ khóa: Dưa hấu (Citrullus vulgaris Schrad. - Dưa hấu là loại trái cây rất được ưa thích ở Việt Nam cũng như ở nhiều nước trên thế giới. - Dưa hấu ăn rất ngon nhưng lại có quá nhiều hạt nên dưa hấu không hạt được nhiều người ưa chuộng. - Dưa hấu không hạt đã được lai tạo thành công và trồng rộng rãi ở Mỹ từ hơn 40 năm trước và ngày càng trở nên phổ biến hơn so với dưa hấu có hạt. - Hiện nay, có rất nhiều giống dưa hấu không hạt đã được lai tạo ra. - Dưa hấu không hạt là một phần của chiến lược sản xuất dưa đã có từ lâu ở thị trường, đem lại lợi tức cao hơn so với dưa hấu có hạt.. - Các giống dưa hấu không hạt được tạo thành do lai giữa cây mẹ tứ bội (tetraploid, 4n = 44) với cây cha nhị bội (diploid, 2n = 22). - Từ năm 1939, Kihara đã nghiên cứu cây dưa hấu không hạt và đã đưa ra thị trường cây lai tam bội sau 12 năm. - Tuy nhiên, đến nay giống dưa hấu không hạt vẫn cần phải được cải thiện không ngừng để thương mại hóa và mở rộng nhanh thị trường. - Cây dưa hấu cha mẹ tứ bội được tạo thành bằng cách xử lý cây con nhị bội với colchicine nơi vườn ươm (Andrus et al., 1971). - Ngày nay, nhờ vào sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô, việc xử lý colchicine để tạo cây đa bội đã được tiến hành bằng nuôi cấy “in vitro” (Hasnain et al., 2003).. - Đề tài “ Tạo cây dưa hấu tứ bội bằng xử lý colchicine in vitro” được thực hiện nhằm tìm nồng độ xử lý colchicine thích hợp để tạo cây dưa hấu tứ bội in vitro, làm nguồn cây mẹ cho công tác lai tạo cây dưa hấu tam bội không hạt.. - Giống dưa hấu nhị bội (Sugar Baby) nhập từ Mỹ, có dạng trái tròn, trọng lượng trung bình 3-5 kg, vỏ màu xanh đen, ruột đỏ, thời gian sinh trưởng 65-70 ngày, là giống thụ phấn tự do.. - Hạt dưa hấu được vô trùng với dung dịch chlorin 8% trong 5 phút, rửa với nước cất 2 lần trước khi tiến hành lột vỏ. - Môi trường được dùng để chuyển mẫu sau khi được xử lý là môi trường Murashige &. - Cây con 3 ngày tuổi in vitro được cắt bỏ 1/3 tử diệp và phần gốc, giữ lấy trục hạ diệp dài 1 cm và cấy vào môi trường MS trên có hoặc không bổ sung BA 1 mg/l, sau đó một ngày các mẫu này được xử lý với colchicine. - sung BA 1 mg/l trong thời gian xử lý là 4 ngày, 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 2 keo, mỗi keo cấy 5 mẫu.. - 0,01 và 0,025%) và 2 thời gian xử lý (4 và 6 ngày) gồm 6 nghiệm thức, 8 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 1 keo, mỗi keo 5 mẫu tương ứng với 5 hạt, trong môi trường có bổ sung BA 1 mg/l.. - Mẫu hạt sau xử lý được cấy vào môi trường mới có BA 0,5 mg/l, đặt trong điều kiện chiếu sáng là 14 giờ, cường độ 1.500 lux, nhiệt độ phòng từ 26 ± 2 0 C.. - Chọn những cây xử lý (3 tuần sau khi cấy chuyền) từ 4 nghiệm thức xử lý colchicine (mỗi nghiệm thức hai mẫu) có những đặc điểm thân to, lá dày hơn, phiến lá rộng, màu xanh đậm hơn cây lưỡng bội tương ứng và mẫu đối chứng.. - Mẫu lá dưa hấu in vitro có diện tích 0,5 cm 2 được cắt nhỏ, chứa vào đĩa petri nhựa, thêm vào 2 ml dung dịch trích DNA (solution A of the High Resolution Kit for Plant DNA, Partec) trong 5 phút, sau đó dung dịch được lọc qua màng lọc nylon 30 μm. - Phân tích số liệu: Các số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm thống kê MSTATC. - 3.1 Hiệu quả của colchicine và BA trên sự tạo thành cây dưa hấu tứ bội 3.1.1 Tỷ lệ sống. - Kết quả này phù hợp với nghiên cứu xử lý colchicine của Gu et al. - và số chồi của mẫu dưa hấu xử lý colchicine sau 2 - 4 tuần nuôi trong môi trường có hoặc không có BA. - Nghiệm thức Tỷ lệ sống. - ns: khác biệt không có ý nghĩa thống kê. - khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. - Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. - Đến 4 tuần sau khi cấy, nghiệm thức có hay không xử lý colchicine 0,01% nhưng có bổ sung BA trong cho số chồi cao nhất là 5,3 -5,4 chồi, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với 2 nghiệm thức xử lý colchicine 0,01% và 0,05% không bổ sung BA là 3,7 và 2,6 chồi và nghiệm thức xử lý colchicine 0,05% bổ sung BA là 3,2 chồi (Hình 1).. - Kết quả bảng 2 cho thấy sau 2 tuần nuôi cấy chiều cao của chồi dưa cao nhất ở nghiệm thức đối chứng 3,09 cm, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với các nghiệm thức còn lại. - chiều cao thấp nhất ở nghiệm thức xử lý colchicine 0,01% là 0,9 cm khác biệt không có ý nghĩa so với nghiệm thức xử lý 0,05% có bổ sung BA là 0,95 cm và nghiệm thức xử lý 0,01% có bổ sung BA là 1,62 cm.. - Đến 4 tuần sau khi nuôi cấy chiều cao của chồi dưa vẫn cao nhất ở các nghiệm thức đối chứng không xử lý và không bổ sung BA là 5,73 cm, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với các nghiệm thức còn lại. - Nghiệm thức xử lý colchicine 0,05% có bổ sung BA có chiều cao thấp nhất là 1,45 cm (Hình 1).. - Bảng 2: Chiều cao (cm) và số lá cây dưa hấu xử lý colchicine trong môi trường nuôi cấy có hoặc không có BA sau 2 - 4 tuần. - Nghiệm thức Chiều cao (cm) Số lá. - khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 1%. - Hình 1: Chồi dưa hấu trong môi trường nuôi cấy 4 tuần sau xử lý. - Kết quả bảng 2 cũng cho thấy sau 2 tuần nuôi cấy số lá trên chồi dưa cao nhất ở nghiệm thức không xử lý colchicine và không bổ sung BA là 3,6 cm, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với các nghiệm thức xử lý colchicine 0,05% có hay không có bổ sung BA là 1,1 lá, nhưng khác biệt không có ý nghĩa so với nghiệm thức không xử lý colchicine có bổ sung BA là 2,9 chồi.. - Đến 4 tuần sau khi nuôi cấy số lá của chồi dưa vẫn cao nhất ở các nghiệm thức đối chứng không xử lý và không bổ sung BA là 5,1 khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với các nghiệm thức xử lý colchicine 0,05% có hay không có bổ sung BA là 1,5 lá, nhưng khác không có ý nghĩa so với nghiệm thức không xử lý colchicine và bổ sung BA là 3,8 lá (Hình 1).. - Bảng 3 cho thấy chồi có hình thái tứ bội cao nhất ở nghiệm thức xử lý colchicine 0,05% là 22,5%, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với nghiệm thức xử lý colchicine 0,01% (0. - Tuy nhiên, có lẽ do nồng độ xử lý này cao nên sự sinh trưởng của chồi rất chậm (Hình 1).. - chồi có hình thái tứ bội sau 4 tuần xử lý colchicine và số khí khẩu. - Nghiệm thức Tỷ lệ. - khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%. - Nghiệm thức xử lý colchicine 0,05% có bổ sung BA có số khí khẩu trên mm² lá thấp nhất là 189 khẩu, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với nghiệm thức không xử lý và xử lý colchicine 0,01% có bổ sung BA là 327 và 296 khẩu.. - Tóm lại, kết quả thí nghiệm trên cho thấy xử lý colchicine 0,05% có bổ sung BA 1mg/l cho được tỉ lệ cây có hình thái tứ bội khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng và nồng độ 0,01%. - Tuy nhiên, kết quả này có hạn chế về sinh trưởng của cây nên cần nghiên cứu tiếp ở nồng độ xử lý thấp hơn.. - 3.2 Hiệu quả của colchicine và thời gian xử lý trên sự tạo thành cây dưa hấu tứ bội. - của mẫu cấy biến thiên từ 97,9% ở các nghiệm thức xử lý colchicine đến 100% ở nghiệm thức đối chứng, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. - của mẫu cấy sau 1-3 tuần xử lý colchicine ở các nồng độ và thời gian khác nhau. - Nghiệm thức. - khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5. - Đến 3 tuần, nồng độ xử lý 0,025% có tỷ lệ sống là 79,3%, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với đối chứng là 100%, nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với 0,01% colchicine (87,95. - Giữa đối chứng và nồng độ xử lý 0,01% không khác biệt nhau. - Qua ba tuần khảo sát, thời gian xử lý không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống cũng như không có sự tương tác giữa nồng độ colchicine và thời gian xử lý lên tỷ lệ sống của chồi dưa hấu.. - Nồng độ 0,025% có số chồi gia tăng khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng. - Thời gian xử lý không ảnh hưởng đến số chồi gia. - Không có sự tương tác giữa nồng độ colchicine và thời gian xử lý trong số chồi gia tăng.. - Bảng 5: Số chồi gia tăng (chồi/mẫu) của cây dưa hấu xử lý colchicine ở các nồng độ và thời gian khác nhau sau ba tuần nuôi cấy. - Nồng độ colchicine. - khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1%. - Hình 2: Chồi dưa hấu phát triển sau 3 tuần nuôi cấy có xử lý colchicine (A) và đối chứng (B). - Bảng 6 cho thấy, sau ba tuần nuôi cấy nồng độ colchicine cũng như thời gian xử lý không ảnh hưởng đến chiều cao gia tăng của chồi. - Có sự tương tác giữa nồng độ colchicine và thời gian xử lý trên chiều cao gia tăng của chồi dưa hấu, nồng độ colchicine 0,01% cùng 6 ngày xử lý cho chiều cao gia tăng cao nhất là 1,7cm, khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại.. - Bảng 6: Chiều cao gia tăng (cm) của chồi dưa hấu xử lý colchicine sau 3 tuần nuôi cấy Nồng độ colchicine. - Bảng 7: Số lá gia tăng (lá/cụm chồi) trên mẫu chồi dưa hấu xử lý colchicin ở các nồng độ và thời gian khác nhau sau ba tuần nuôi cấy. - khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5. - Số lá gia tăng ở nồng độ colchicine 0,025% và đối chứng khác biệt nhau không có ý nghĩa.. - Số lá gia tăng không bị ảnh hưởng bởi thời gian xử lý nhưng chịu sự ảnh hưởng tương tác giữa nồng độ colchicine và thời gian xử lý. - Số lá gia tăng cao nhất là 7,1 lá/cụm chồi ở nghiệm thức xử lý colchicine 0,01% trong thời gian 6 ngày, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức cò̀n lại (Bảng 7).. - Nhìn chung, xử lý colchicine ở nồng độ 0,01% tỏ ra thuận lợi cho sự tăng trưởng chiều cao và số lá của dưa hấu (Hình 2). - Bảng 8 cho thấy số khí khẩu trên một đơn vị diện tích lá ở cây dưa hấu tứ bội là 220 cái/mm 2 , thấp hơn phân nửa so với số khí khẩu ở cây nhị bội là 456 cái/mm 2 (Hình 3). - Theo Ngô Thị Nhàng (2008), số khí khẩu ở mặt dưới lá cây dưa hấu nhị. - Bảng 8: Số khí khẩu mặt dưới của lá cây dưa hấu xử lý colchicine. - Cây dưa hấu Số khí khẩu (/mm 2. - Hình 3: Khí khẩu của cây dưa hấu nhị bội (A) và tứ bội (B) ở 400X. - của cây dưa hấu 2n và các cây xử lý colchicine được tuyển chọn và đếm số khí khẩu.. - Mẫu dưa hấu đối chứng (2n) cho “peak” 1 ở vạch 100 (Hình 4A) so với cây tứ bội (4n) cho “peak” 1 ở vạch 200 tương ứng với mức bội thể 4n (Hình 4B).. - Kết quả phân tích đã tìm được 4 cây tứ bội, chiếm tỉ lệ 10% số cây thuộc nghiệm thức xử lý colchicine 0,025% t t ro r on ng g thời gian 6 ngày. - Hình 4: Biểu đồ phân tích tế bào học “flow cytometry” của cây dưa hấu 2n (A) và 4n (B). - 3.2.7 Sinh trưởng in vivo của cây dưa hấu tứ bội. - Các cây dưa hấu tứ bội được xác định bằng “Flow cytometry” được nhân hệ số và. - Ghi nhận sự sinh trưởng và phát triển của các cây dưa hấu này cho thấy chúng rất mạnh khỏe, có thân, lá, hoa to lớn, khác biệt so với cây nhị bội (Hình 5).. - Hình 5: Sinh trưởng ngoài đồng của cây dưa hấu tứ bội (4n) được tạo thành bằng colchicine (A) có lá (B) và hoa đực (CD) to lớn hơn so với đối chứng (2n). - Nghiên cứu t ạo cây dưa hấu tứ bội bằng xử lý cây nhị bội in vitro với colchicine cho thấy:. - Nồng độ colchicine cao (0,05%) đã hạn chế sự sinh trưởng của chồi dưa hấu.. - Nồng độ colchicine 0,025% cùng thời gian xử lý 6 ngày cho hiệu quả tạo cây tứ bội cao nhất, đạt tỷ lệ 10%.. - Các dòng dưa hấu tứ bội trồng ngoài đồng có sự sinh trưởng phát triển mạnh hơn cây nhị bội, khác biệt về hình thái, kích thước lá hoa.. - Sử dụng colchicine 0,025% cùng thời gian xử lý 6 ngày để tạo cây dưa hấu tứ bội in vitro.. - Nhân giống cây dưa hấu tam bội (Citrullus vulgaris Schrad.) in vitro. - Nhân giống cây dưa hấu tam bội (Citrullus vulgaris Schrad. - Hiệu quả của colchicine lên sự sinh trưởng và phát triển của cây dưa hấu nhị bội (Citrullus vulgaris Schrad.) in vitro”. - Hiệu quả của colchicine đến sự tạo thành cây dưa hấu tứ bội