- Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen. - Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm. - Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. - Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A. - Chọn lọc thể nấm chuyển gen trên môi trường kháng sinh. - Bởi vậy, nghiên cứu sản xuất và ứng dụng enzyme xylanase có chất lượng cao, ổn định từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhờ công nghệ chuyển gen đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu [22, 31]. - Hơn nữa, kỹ thuật chuyển gen cho phép chọn lựa promoter đặc hiệu cũng như các chủng vi sinh vật chuyển gen mong muốn, nhờ vậy đặc tính của enzyme tái tổ hợp đã được cải thiện [22].. - Hiện nay, kỹ thuật chuyển gen thông vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được sử dụng phổ biến trên thế giới để chuyển gen vào thực vật. - Bởi đây là một hệ thống chuyển gen có hiệu suất cao, ổn định và đơn giản. - Agrobacterium đã và đang được nghiên cứu, áp dụng để chuyển gen vào nấm mốc [3, 9]. - Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài Mục tiêu Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ chuyển gen để thiết kế Ti–plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B. - Trên cở sở đó tạo các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp phục vụ công tác chuyển gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B vào A. - tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm mốc.. - Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. - Kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng để chuyển các gen mong muốn vào thực vật, nấm (nấm men) nhằm nâng cao năng suất, kháng sâu bệnh và nâng cao chất lượng sản phẩm [22]. - Chuyển gen vào A. - Chuyển gen vào nấm thường được tiến hành theo hai cách: trực tiếp và gián tiếp. - Ngoài các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp, chuyển gen có thể được thực hiện một cách gián tiếp thông qua vi khuẩn A. - Phương pháp này đã và đang được nghiên cứu và ứng dụng để chuyển gen vào nấm mốc . - tumefaciens được sử dụng như một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen vào nhiều loài nấm, chẳng hạn như A. - Không chỉ vậy, chuyển gen thông qua A. - tumefaciens cũng đã được áp dụng để chuyển gen vào tế bào người [26]. - Tuy nhiên, vi khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển gen vào chúng một đoạn DNA nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gây nên trình trạng phát sinh khối u. - Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường [1, 22]. - Tần suất tái tổ hợp tương đồng khác nhau khi chuyển những đoạn gen có kích thước khác nhau, nhưng hiệu quả chuyển gen sẽ tăng khi giảm tỷ lệ các đoạn tương đồng [26]. - Các hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium. - Điều này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ. - iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A. - tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp. - Với các kiểu plasmid như trình bày trên có thể tiến hành chuyển gen gián tiếp thông Agrobacterium vào nhiều loài nấm mốc khác nhau . - niger Nhờ khả năng chuyển DNA sang tế bào vật chủ và phổ vật chủ rộng mà chuyển gen nhờ A. - tumefaciens trở thành kỹ thuật thông dụng để chuyển gen vào nhiều đối tượng khác nhau, ví dụ: thực vật, vi sinh vật [22, 26]. - Hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium vào nấm men thấp hơn so với chuyển gen vào thực vật và thấp hơn so với các phương pháp truyền thống, ví dụ: xung điện [9].. - Chuyển gen thông qua Agrobacterium đã được Nyilasi ứng dụng để chuyển gen kháng hygromycin B vào Zygomycetes [15]. - Agrobacterium cũng được sử dụng để chuyển gen vào nấm sợi, chẳng hạn như: Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Trichoderm, Neurospora, trong đó phổ biến nhất là các loài Aspergillus, bao gồm: A. - 1: Các loài nấm được dùng trong chuyển gen thông qua Agrobacterium [9]. - Deuteromycotiana Deuteromycetes Hyphomycetes Aspergillus niger Aspergillus awamori Fusarium solani Fusarium graminearum Trichoderma reesei Coelomycetes Melanconiaceae Colletotrichuni gloeosporioides Chuyển gen vào nấm mốc gián tiếp thông qua A. - tumefaciens có mang các vùng gen độc trong DNA của chúng, các gen độc sẽ cảm ứng vi khuẩn chuyển gen quan tâm sang tế bào chủ khi có mặt các chất cảm ứng. - iv) chủng vi khuẩn chuyển gen sẽ được tiến hành nuôi nhiễm với bào tử nấm A. - Nấm chuyển gen tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để làm ổn định nguồn gen [11, 22].. - Như vậy, phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium không khác nhiều so với phương pháp chuyển gen vào thực vật. - Đó là chúng đều cần một sinh vật chuyển gen gián tiếp, một Ti plasmid tái tổ hợp đã ghép nối đoạn gen mong muốn, và đều phải có mặt chất cảm ứng… Tuy nhiên, với nấm mốc, quá trình chuyển T- DNA nhờ Agrobacterium được thực hiện thông qua quá trình nuôi chung (nuôi nhiễm) trên một giá thể đặc biệt là các màng lọc để thuận lợi cho việc chuyển màng sang môi trường chọn lọc thể chuyển gen [9]. - Chuyển gen vào nấm mốc thông qua vi khuẩn A. - Mặc dù hiệu suất chuyển gen cao, nhưng trên thực tế, phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn enzyme để chuẩn bị thể nguyên sinh [18]. - Tần suất chuyển gen cao: Hầu hết chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium có tần suất cao hơn so với các phương pháp truyền thống . - awamori thông qua Agrobacterium có hiệu suất cao gấp 400 lần so với các phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng PEG [9]. - Với vật chủ là Colletotrichum gloeosporioides, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacteium cao gấp 5 – 10 so với chuyển gen nhờ tế bào trần. - Với một số vật chủ khác, chẳng hạn như Neurospora crassa, Trichoderma reesei, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium tương tự với hiệu suất chuyển gen nhờ tế bào trần đã được tối ưu [9]. - Tương tự, chuyển gen vào A. - fumigatus thông qua vi khuẩn Agrobacterium, hiệu suất chuyển gen cao gấp 2 lần so với chuyển gen nhờ các hạt cầu [16. - So với các phương pháp cũ chuyển gen vào tế bào trần chỉ có thể chuyển được những đoạn DNA có kích thước khoảng 40 kb, đoạn DNA ngoại lai nhỏ nhất có thể chuyển vào tế bào thực vật nhờ A. - Các thể chuyển gen nhờ Agrobacterium thu được đều có copy duy nhất, và gen được chuyển hòa nhập một cách ngẫu nhiên vào genome của tế bào chủ [11, 16. - Phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông Agrobacterium là phương pháp nền tảng trong sản xuất thực phẩm bởi các chủng nấm mốc không chứa các yếu tố kháng kháng sinh vi khuẩn [9]. - Ngoài ra, chuyển gen nhờ Agrobacterium là phương pháp thuận lợi để nghiên cứu chức năng của gen, nghiên cứu tạo gen đột biến [11, 29].. - Bên cạnh những thuận lợi trên, chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. - Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium. - Chuyển gen vào nấm thông qua A. - Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium cũng khác nhau khi sử dụng các loài nấm khác nhau. - Do đó, để hiệu suất chuyển gen đạt được cao nhất, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen cần được tối ưu hóa [18. - Một trong những thuận lợi của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium là nguyên liệu ban đầu dùng cho chuyển gen gen rất đa dạng. - với loài Coccidioides immitis chuyển gen chỉ có thể sử dụng bào tử mầm. - hiệu suất chuyển gen ở Agaricus bisporus khi dùng bào tử mầm làm nguyên liệu ban đầu sẽ cao hơn so với dùng thể sợi nấm [12].. - Một nhân tố khác ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen vào nấm là thời gian bảo quản bào tử nấm. - Agrobacterium và tế bào chủ Chủng giống sử dụng cho cho chuyển gen thông qua Agrobacterium cũng rất đa dạng, ví dụ: LBA 4404, EHA 105, LBA 1100. - Hiệu suất chuyển gen khi sử dụng các chủng trên là như nhau nên thật khó để kết luận được sử dụng chủng nào là tốt nhất. - Ngoài ra, với cùng một hiệu suất chuyển gen cũng rất đa dạng khi chuyển gen vào nấm được phân lập theo những cách khác nhau. - Bởi vậy, không thể đưa ra kết luận chủng Agrobacterium nào thích hợp để chuyển gen vào nấm [12. - Tỷ lệ nuôi nhiễm Yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chuyển gen là tỷ lệ nuôi nhiễm giữa vi khuẩn Agrobacterium và nấm mốc. - Tăng tế bào Agrobacterium hoặc nấm có thể làm tăng hiệu suất chuyển gen. - Điều kiện cùng nuôi nhiễm Điều kiện cùng nuôi nhiễm là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen. - Ngoài ra, nhiều loại màng lọc khác nhau như cellulose, nitrocellulose, Hybond N+ cũng sẽ cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [11, 12]. - Ngoài các yếu tố trên, còn một số các yếu khác cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen chẳng hạn như nồng độ chất kháng sinh, hoặc cũng có thể do Quy trình chuyển gen không phù hợp với tế bào chủ. - Do vậy, để đạt hiệu suất chuyển gen cao nhất, điều kiện chuyển gen cần phải được tối ưu [12]. - Chọn lọc nấm chuyển gen. - tumefaciens được nuôi chung với bào tử nấm trong môi trường có bổ sung chất cảm ứng AS, cảm ứng gen vir để chuyển gen mong muốn sang tế bào chủ. - Nấm mốc chuyển gen được chọn lọc dựa trên đặc tính của đoạn DNA ngoại lai hoặc biểu hiện ra sản phẩm protein. - Thông thường, cơ thể chuyển gen được chọn lọc trên môi trường có bổ sung kháng sinh thích hợp [8]. - Để tạo chủng Agrobacterium làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm, việc đầu tiên là thiết kế Ti plasmid vector biểu hiện, vector này được kí hiệu pCB_xylB_hph gen mã hóa xylanase (xylB) và gen kháng hygromycin B (hph).. - Nấm chuyển gen sẽ được tiếp tục chọn lọc trên môi trường có bổ sung chất kháng sinh thích hợp. - Để tạo ra được nguyên liệu chuyển gen thực vật, Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph phải được chuyển vào một tế bào để làm ổn định nguồn gen. - Hơn nữa, tế bào sinh vật này phải có khả năng chuyển gen quan tâm vào vật chủ mong muốn. - Cho đến nay, chuyển gen nhờ Agrobacterium đã và đang được áp dụng rộng rãi trong chuyển gen vào thực vật và một số vi sinh vật chẳng hạn như nấm, vi khuẩn. - tumefaciens và sử dụng chủng vi sinh vật này làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm sợi. - Các dòng khuẩn lạc sau khi kiểm tra sẽ được lưu giữ để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm.. - Nhờ sự có mặt của chất cảm ứng AS, các gen vir trở nên hoạt hóa, và quá trình chuyển gen vào nấm mốc được diễn ra dưới sự hỗ trợ của các gen vir. - Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nhiều nghiên cứu về chuyển gen vào nấm nhờ Agrobacterium trên thế giới . - Trên môi trường chọn lọc thể chuyển gen đã không xuất hiện khuẩn lạc nào nếu trong giai đoạn nuôi nhiễm không được bổ sung thêm AS. - Kết quả này cũng tương tự với kết quả của Wang và các tác giả khác (2008) khi nghiên cứu chuyển gen vào nấm P. - Mặc dù hiệu suất chuyển gen vào nấm sợi thông qua Agrobacterium có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, tuy nhiên, rõ ràng có thể thấy AS làm giảm hiệu suất chuyển gen. - Do vậy, bổ sung AS trong giai đoạn nuôi nhiễm là cần thiết để đạt hiệu suất chuyển gen cao nhất . - Hiệu suất chuyển gen vào P. - Theo Beijersbergen và các tác giả khác (2001), chuyển gen vào nấm mốc A. - Chuyển gen vào nấm mốc A. - Sự phát triển mạnh của nấm cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen do sự cạnh tranh dinh dưỡng. - Nấm chuyển gen sau khi chọn lọc trên môi trường có bổ sung kháng sinh hygromycin B sẽ tiếp tục được nuôi lượng lớn trong môi trường DPA lỏng để thu cặn tế bào. - niger được sử dụng làm tế bào chủ để chuyển gen bởi nó là loài an toàn, cho năng suất và chất lượng enzyme xylanase, và đây là loài rất phổ biến trong tự nhiên[8]. - Đã tạo được chủng vi khuẩn Agrobacterium mang vector biểu hiện gen mã hóa xylanase pCB_xylB_hph để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm. - niger chuyển gen trên môi trường chọn lọc bằng kháng sinh hygromycin B.. - Tiếp tục hoàn thiện quy trình chuyển gen mã hóa xylanase vào nấm mốc A. - Kiểm tra nấm chuyển gen bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho hph và xylB.