- THỬ NGHIỆM LÊN MEN ETHANOL Ở NHIỆT ĐỘ CAO BẰNG NẤM MEN CHỊU NHIỆT Nguyễn Hữu Tường 1 , Phạm Hồng Quang 1 , Ngô Thị Phương Dung 1 , Huỳnh Xuân Phong 1 và. - Candida tropicalis, khả năng chịu ethanol, lên men ethanol, nấm men chịu nhiệt Keywords:. - Sử dụng nấm men chịu nhiệt vào việc sản xuất ethanol là vấn đề đang được quan tâm và chú ý vì chúng có khả năng tăng trưởng và lên men ở điều kiện nhiệt độ cao, phù hợp với điều kiện khí hậu các nước nhiệt đới, trong đó có Việt Nam.. - Trong nghiên cứu này, 37 dòng nấm men từ các đề tài nghiên cứu trước được thử khả năng chịu nhiệt ở các mức nhiệt độ khác nhau và 47ºC) trong hai ngày. - Các dòng nấm men chịu nhiệt được khảo sát khả năng chịu ethanol trong môi trường sucrose 20ºBrix ở các mức độ ethanol lần lượt là và 12% (w/v). - Dòng nấm men có khả năng chịu nhiệt và chịu ethanol tốt tiếp tục được khảo sát khả năng lên men ở những điều kiện khác nhau: mật số giống chủng và 10 7 tế bào/mL), nồng độ đường ban đầu và 30ºBrix) và pH của môi trường (4,0. - Kết quả cho thấy có 18 dòng nấm men chịu được nhiệt tương đối cao ở 43ºC và 4 dòng phát triển được ở nhiệt độ 45ºC (HX1, N1, MO và T), trong đó HX1 có khả năng chịu được ethanol ở nồng độ 9% tốt hơn so với ba dòng còn lại. - Điều kiện thích hợp cho dòng nấm men HX1 phát triển và lên men ethanol là mật số giống chủng ban đầu 10 5 tế bào/mL, nồng độ đường ban đầu 20ºBrix và pH môi trường 4,5. - Nấm men có tiềm năng rất lớn trong việc lên men chuyển hóa đường thành ethanol. - Tuy nhiên, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của nấm men như nguồn carbon, nguồn nitơ, pH, đặc biệt là nhiệt độ và nồng độ ethanol. - Do đó, đặc tính chịu nhiệt và chịu ethanol của nấm men rất quan trọng trong việc tổng hợp ethanol thông qua quá trình lên men được thực hiện bởi nấm men.. - Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự lên men tạo ethanol của nấm men. - Do đó, việc sản xuất ethanol sinh học bằng nấm men gặp nhiều khó khăn và thách thức. - Chi phí dùng cho việc làm lạnh rất tốn kém, nên việc chọn lọc các dòng nấm men chịu nhiệt có thể giúp giảm thiểu chi phí, tận dụng được một số thuận lợi khi thực hiện lên men ở nhiệt dộ cao như: độ tan của oxy và các chất khí khác giảm tạo điều kiện kỵ khí rất tốt, cơ hội bị nhiễm được giảm thiểu (Roehr, 2001).. - Nồng độ ethanol trong môi trường cũng tác động đáng kể đến năng suất lên men của nấm men, nấm men không chịu được nồng độ ethanol cao sẽ dễ bị ức chế trong quá trình lên men dẫn đến hiệu quả lên men không cao. - Những dòng nấm men có khả năng phát triển và lên men ethanol ở nhiệt độ cao, đồng thời kết hợp được đặc tính chịu được nồng độ ethanol cao rất có triển vọng cho việc sản xuất ethanol.. - Thành phần dinh dưỡng của môi trường cũng như pH cũng ảnh hưởng nhất định đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men. - Giá trị pH không thích hợp sẽ hạn chế khả năng tạo ethanol của nấm men. - Mục tiêu của đề tài là chọn lọc dòng nấm men có khả năng chịu được nhiệt độ và nồng độ ethanol cao đồng thời có khả năng lên men mạnh;. - khảo sát điều kiện lên men thích hợp cho dòng nấm men này.. - 37 dòng nấm men đã được phân lập từ đề tài của Nguyễn Vân Anh et al. - 2.2.1 Khảo sát khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ cao của các dòng nấm men. - Cấy 37 dòng nấm men được tuyển chọn lên đĩa petri có chứa môi trường YM agar, mỗi dòng thành 1 đường. - Ủ các đĩa petri ở các nhiệt độ khác nhau và 47ºC trong 48 giờ.. - Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các dòng nấm men trên môi trường thạch. - Tuyển chọn những dòng nấm men có khả năng phát triển mạnh ở nhiệt độ cao.. - 2.2.2 Khảo sát khả năng chịu ethanol của các dòng nấm men. - Nuôi cấy các dòng nấm men tuyển chọn từ thí nghiệm 2.2.1 trong môi trường PGY đến khi mật số nấm men đạt 10 8 tế bào/mL. - Chủng nấm men đã nuôi cấy vào các bình tam giác chứa 100 mL dung dịch đường sucrose (20ºBrix) có bổ sung ethanol tinh khiết với các nồng độ khác nhau: 0%,. - điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ thích hợp chọn từ thí nghiệm 2.2.1. - Tuyển chọn các dòng nấm men có mật số cao.. - 2.2.3 Khảo sát khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao của các dòng nấm men đã được tuyển chọn. - Nuôi cấy nấm men trong môi trường PGY đến khi mật số tế bào nấm men đạt 10 8 tế bào/mL.. - Chủng 1 mL nấm men đã nuôi cấy vào các bình tam giác chứa 99 mL dung dịch nước mía (20ºBrix). - Ủ 5 ngày trong điều kiện kỵ khí ở các nhiệt độ khác nhau ºC. - Tuyển chọn các dòng nấm men cho nồng độ ethanol cao ở nhiệt độ cao.. - 2.2.4 Khảo sát điều kiện lên men ethanol ở nhiệt độ cao. - 2.2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của mật số giống chủng Nuôi cấy nấm men trong môi trường PGY đến khi mật số tế bào nấm men đạt và 10 9 tế bào/mL. - Ủ 5 ngày trong điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ thích hợp (chọn từ thí nghiệm 2.2.3).. - Chưng cất dịch lên men để thu ethanol và đo nồng độ ethanol thu được.. - 2.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường Nuôi cấy nấm men trong môi trường PGY, điều chỉnh cho mật số tế bào nấm men tới giá trị thích hợp (chọn từ thí nghiệm 2.2.4.1). - Chủng 1 mL nấm men đã nuôi cấy vào các bình tam giác chứa 99 mL dung dịch đường mía ở 5 độ Brix khác nhau và 30ºBrix. - Ủ 5 ngày trong điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ thích hợp (chọn ở thí nghiệm 2.2.3). - Nuôi cấy nấm men trong môi trường PGY,. - điều chỉnh đến mật số tế bào nấm men thích hợp (chọn từ thí nghiệm 2.2.4.1). - Chủng 1 mL nấm men đã nuôi cấy vào các bình tam giác chứa 99 mL dung dịch nước mía có nồng độ đường ban đầu thích hợp (được chọn từ thí nghiệm 2.2.4.2) và giá trị pH ở các bình khác nhau: 4,0. - Ủ 5 ngày trong điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ thích hợp đã được chọn ở thí nghiệm 2.2.3. - 2.2.5 Định danh những dòng nấm men có đặc tính tốt. - Chọn lọc những dòng nấm men mang đặc tính tốt từ các thí nghiệm để tiến hành khảo sát đặc tính sinh học của nấm men bằng phương pháp quan sát khuẩn lạc, chụp hình dưới kính hiển vi và định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử.. - Dòng nấm men có đặc tính tốt được gửi đến công ty Microgene để ly trích DNA và khuếch đại vùng ITS1, ITS2 và 5.8S rDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi tổng 518F (5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’) và 800R (5’-TACCAGGGTATCTAATCC-3. - Dựa vào phần mềm BLAST để so sánh mức độ tương đồng với dữ liệu trên ngân hàng gene của NCBI (National Center for Biotechnology Information) trên trang web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ và xác định loài của dòng nấm men.. - 3.1 Khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ cao và khả năng chịu ethanol của 37 dòng nấm men Sau 48 giờ cấy nấm men trên môi trường dinh dưỡng, tất cả các dòng nấm men đều phát triển trong khoảng nhiệt độ 30 - 40ºC. - Ở mức nhiệt độ 43ºC, chỉ có 18 dòng phát triển. - Đến mức nhiệt độ 45ºC chỉ còn quan sát được sự phát triển của 4 dòng nấm men HX1, MO, N1 và T (Hình 1).. - Không có dòng nấm men nào phát triển và tạo khuẩn lạc ở 47ºC sau 48 giờ ủ (Bảng 1). - Điều này chứng tỏ nhiệt độ là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của các dòng nấm men.. - Hình 1: Khuẩn lạc của 4 dòng nấm men HX1, MO, N1 và T ở 45 º C sau 48 giờ ủ Bảng 1: Khảo sát khả năng chịu nhiệt của 37 dòng nấm men sau 48 giờ. - STT Dòng nấm men Nhiệt độ khảo sát. - Kết quả đã chọn được 4 dòng (HX1, MO, N1 và T) từ 37 dòng nấm men có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ cao.. - 3.2 Khả năng chịu ethanol của các dòng nấm men Khả năng chịu ethanol của 4 dòng nấm men được thể hiện trong Bảng 2.. - Bảng 2: Khả năng chịu ethanol của 4 dòng nấm men. - Dòng nấm men 0% ethanol 3% ethanol 6% ethanol 9% ethanol 12% ethanol. - Nhìn chung, mật số nấm men sẽ giảm khi tăng nồng độ ethanol. - Mật số nấm men đạt cao nhất ở nghiệm thức đối chứng (0% ethanol). - Điều này chứng tỏ ethanol là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của các dòng nấm men. - Ở mức độ 9% ethanol, mật số nấm men của dòng nấm men HX1 đạt giá trị lớn nhất (5,66 log CFU/mL). - Lựa chọn được dòng nấm men HX1 có. - khả năng chịu ethanol ở 9% khác biệt có ý nghĩa so với 3 dòng nấm men còn lại ở độ tin cậy 95%.. - 3.3 Khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao của dòng nấm men được tuyển chọn. - Khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao của dòng nấm men HX1 được ghi nhận qua Hình 2.. - Hình 2: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ ủ lên nồng độ ethanol sinh ra. - Nồng độ ethanol cao nhất được ghi nhận ở 30ºC (9,81. - Ở các nghiệm thức còn lại, khi nhiệt độ tăng thì nồng độ ethanol sinh ra giảm.. - Nồng độ ethanol sinh ra giảm mạnh nhất khi tăng nhiệt độ từ 35ºC lên 40ºC. - Nhiệt dộ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự lên men tạo ethanol của nấm men. - Theo Navarro và Durand (1978) khi nhiệt độ tăng cao thì lượng ethanol tích lũy nội bào trong tế bào nấm men tăng cao làm ngưng trệ sự phát. - triển của nấm men. - Vì vậy lượng ethanol sinh ra giảm khi nhiệt độ môi trường tăng. - Vì thí nghiệm được tiến hành nhằm khảo sát khả năng lên men ở nhiệt độ cao của nấm men nên nhiệt độ ủ cho các thí nghiệm tiếp theo được chọn là 35ºC.. - 3.4 Điều kiện lên men ethanol ở nhiệt độ cao 3.4.1 Ảnh hưởng của mật số giống chủng. - Khả năng sinh ethanol của dòng nấm men HX1 với mật số giống chủng khác nhau được ghi nhận qua Hình 3.. - Hình 3: Biểu đồ ảnh hưởng của mật số giống chủng lên nồng độ ethanol. - Ngoài ra, theo Lương Đức Phẩm (2006) khi tỷ lệ nấm men bổ sung càng cao thì tốc độ lên men ở thời gian đầu càng nhanh và. - 3.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ đường. - Khả năng sinh ethanol của dòng nấm men HX1 với nồng độ đường khác nhau được ghi nhận qua Hình 4.. - Hình 4: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ đường lên nồng độ ethanol sinh ra. - Nghiệm thức 10ºBrix cho kết quả nồng độ ethanol thấp nhất (5,89%) có thể do dịch lên men không đủ lượng đường cho nấm men tăng sinh khối và chuyển hóa đường thành ethanol. - Nghiệm thức 25ºBrix cho kết quả nồng độ ethanol 10,38%. - năng suất lên men trong khi nồng độ dịch đường quá cao sẽ làm thay đổi áp suất thẩm thấu gây nguy hiểm đối với tế bào nấm men (Pereira et al., 2010).. - Khả năng sinh ethanol của dòng nấm men HX1 trong các môi trường có giá trị pH khác nhau được ghi nhận qua Hình 5.. - Hình 5: Biểu đồ ảnh hưởng của pH lên nồng độ ethanol sinh ra. - Điều này chứng tỏ pH của môi trường là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của các dòng nấm men. - Giá trị pH 4,5 được chọn là giá trị thích hợp nhất cho dòng nấm men. - 3.5 Định danh những dòng nấm men có đặc tính tốt. - 3.5.1 Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của dòng nấm men HX1 (Hình 6). - Hình 6: Khuẩn lạc dòng nấm men HX1 và tế bào dưới kính hiển vi ở 100X 3.5.2 Định danh dòng nấm men HX1. - Dòng nấm men HX1 được giải trình tự giữa vùng ITS1, ITS2 và 5.8S ribosomal DNA. - Nấm men công nghiệp.. - Tuyển chọn, nghiên cứu nấm men và vi khuẩn chịu nhiệt lên men ethanol. - Phân lập và tuyển chọn các dòng nấm men chịu nhiệt có khả năng lên men ethanol mạnh