- Kết quả đề tài nghiên cứu cho thấy hoạt tính của protease từ dịch trích enzyme thô của trùn quắn trên cả hai cơ chất casein va fibrin đều mạnh hơn so với trùn hổ, trùn quế, trùn cơm và trùn chỉ. - Thời gian thích hợp cho quá trình tự thủy phân để đạt hoạt tính protease cao nhất là 4 ngày. - Tinh sạch bằng tủa acetone, phối hợp với sắc ký trao đổi ion và tương tác kỵ nước, đồng thời phân tích điện di SDS-PAGE nhuộm hoạt tính không có beta-mercaptoethanol trên cơ chất casein cho thấy thành phần protease trong trùn quắn khá phức tạp, có đến 10 phân đoạn enzyme khác nhau với trọng lượng phân tử từ 24,0 kDa đến 58,3 kDa.. - Từ khóa: Trùn Quắn, Pheretima posthuma, protease, đĩa fibrin, sắc ký trao đổi ion, sắc ký tương tác kỵ nước, SDS-PAGE nhuộm hoạt tính. - Ở Việt Nam, các nghiên cứu sơ bộ qua tiến hành xác định hoạt tính thủy phân fibrin tách từ một số loài trùn đất (Thủy et al., 2002), cho thấy ở loài trùn quế (Perionyx excavatus) hoạt tính này. - Những khảo sát ban đầu được tiến hành ở phòng thí nghiệm enzyme Viện NC&PT CNSH cho thấy ngoài trùn quế các loại trùn khác như trùn quắn, trùn cơm, và trùn hổ cũng có hoạt tính protease mạnh, nhưng ở trùn quắn là trội hơn cả. - Đề tài nhằm mục đích khảo sát đặc điểm hệ protease từ trùn quắn (Pheretima posthuma), và xác định hoạt tính thủy phân fibrin trên đối tượng trùn này, đồng thời đưa ra qui trình tinh sạch thích hợp, góp phần làm tăng thêm giá trị của nguồn trùn đất Việt Nam.. - (a) Khảo sát đặc điểm protease trùn quắn. - Hoạt tính thủy phân fibrin: Đĩa fibrin được chuẩn bị như sau: agarose (1,6. - Hoạt tính fibrin của enzyme được so sánh dựa vào diện tích vòng tròn thủy phân tạo thành trên đĩa.. - Hoạt tính thủy phân casein được khảo sát bằng phương pháp Anson cải tiến (Phạm Thị Trân Châu et al.,1997). - Mẫu enzyme được lấy từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 10 và kiểm tra hoạt tính trên casein. - (b) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính protease trùn quắn - Thí nghiệm 3: Khảo sát nhiệt độ tối ưu của bột enzyme thô. - Enzyme được ủ ở các nhiệt độ o C trong 10’, đo hoạt tính trên casein.. - Enzyme được ủ ở các nhiệt độ như thí nghiệm 3 trong 12giờ, sau đó ổn định ở nhiệt độ phòng trong 30’, đo hoạt tính trên casein.. - Đo hoạt tính trên casein.. - Định nghĩa về đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme: 1 ĐVHT enzyme (U (Unit)) là lượng enzyme cần thiết để thủy phân casein, tương đương với 1µM tyrosine sinh ra trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ 37 o C, pH 7.5.. - Hoạt tính đặc hiệu: là số ĐVHT enzyme có trong 1mg protein (U/mg).. - Thu các phân đoạn protein kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp Anson cải tiến và điện di SDS-PAGE nhuộm hoạt tính casein.. - Các phân đoạn enzyme thu được qua sắc ký trao đổi ion được thẩm tích loại muối và cân bằng với dung dịch Tris-HCl pH 8,5 có chứa ammonium sulphate 30%. - Lần lượt từng phân đoạn được cho qua cột. - Thu các phân đoạn protein và kiểm tra hoạt tính như trong thí nghiệm 7.. - Đo hoạt tính enzyme bằng phương pháp Anson cải tiến (Phạm Thị Trân Châu et al.,1997) và hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976). - 3.1 Đặc điểm của protease trùn quắn 3.1.1 Khả năng thủy phân fibrin của. - Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme trên đĩa fibrin cho thấy sau 8 giờ ủ ở 37 o C, cả 5 loài trùn đều có khả năng tạo thành những vòng tròn trong suốt do fibrin bị thủy phân. - Mức độ hoạt tính của các loài trùn được xếp theo thứ tự sau: trùn quắn >. - Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Dao (2005) về hoạt tính thủy phân fibrin của một số loài trùn đất ở Việt Nam.. - Bảng 1: Kết quả đo hàm lượng protein và hoạt tính enzyme của 5 loài trùn trên casein. - Hàm lượng protein (mg/gct Hoạt tính đặc hiệu (U/mg . - Kết quả đo hàm lượng protein và xác định hoạt tính protease trên casein cho thấy trùn quắn có hàm lượng protein thấp nhất (13,54mg/gct), trùn quế khá cao (28,30mg/gct) và cao nhất là trùn chỉ (42,97mg/gct). - Nhưng hoạt tính đặc hiệu của trùn quắn lại cao nhất (0,281U/mg), kế đó là trùn hổ (0,193U/mg) và thấp nhất là trùn quế (0,039U/mg).. - 3.1.2 Khảo sát khả năng tự thủy phân của protease trùn quắn. - Biểu đồ (Hình 2) cho thấy hoạt tính protease trong trùn quắn tăng dần trong 4 ngày đầu tự thủy phân và sau đó tương đối ổn định đến ngày thứ 8, hoạt tính enzyme giảm ở ngày thứ 9 và 10. - Như vậy sau 4 ngày enzyme đã được hoạt hóa hoàn toàn và nếu kéo dài thời gian có khả năng enzyme bị biến tính và giảm hoạt tính.. - ctv 2006), dung dịch enzyme sau khi trích ly tiếp tục ủ trong khoảng một tuần thì hoạt tính protease sẽ tăng, có thể là trong quá trình ủ đã xảy ra sự tự thủy phân các tiền chất enzyme, tạo thành các phân tử enzyme có hoạt tính, tương. - 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của protease trùn quắn 3.2.1 Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt của protease trùn quắn. - Nhiệt độ tối ưu là nhiệt độ mà ở đó enzyme hoạt động mạnh nhất Biểu đồ (Hình 3) cho thấy protease trong trùn quắn hoạt động mạnh trong khoảng nhiệt độ từ 45-65 o C, hoạt tính cao nhất ở 55 o C, mất hoạt tính gần như hoàn toàn khi nhiệt độ tăng đến 75 o C.. - Kết quả khảo sát độ bền nhiệt, biểu đồ (Hình 4) cho thấy protease trong trùn quắn khá bền trong khoảng nhiệt độ dưới 55 o C, hoạt tính bị mất gần như hoàn hoàn sau 15 giờ ủ ở 65 o C và không còn hoạt tính ở 75 o C. - 3.2.2 pH tối ưu và độ bền pH của protease trùn quắn. - Kết quả khảo sát cho thấy protease trùn quắn có hoạt tính yếu ở pH acid và trung tính (Hình 5), hoạt tính mạnh trong khoảng từ pH 8-11và cao nhất là ở pH 8 và pH 10.. - Hình 3: Biểu đồ nhiệt độ tối ưu protease trùn quắn. - Biểu đồ nhiệt độ tối ưu protease trùn quắn. - Nhiệt độ(oC). - Hoạt tính enzyme(U/ml). - Hình 4: Độ bền nhiệt độ protease trùn quắn. - Độ bền nhiệt độ của protease trùn quắn. - Nhiệt độ( o C). - Bảng 3: Hoạt tính đặc hiệu của protease trùn quắn sau khi tủa với acetone. - Hoạt tính đặc hiệu protease trong trùn quắn sau khi tủa với acetone tăng lên gấp 1,84 lần so với mẫu enzyme thô. - Ngoài ra, hàm lượng protein đã giảm xuống sau khi tủa, chứng tỏ tủa bằng acetone đã loại bỏ được một số protein tạp nên làm tăng hoạt tính đặc hiệu của enzyme trong trùn quắn. - Các protein của dung dịch enzym thô được phân tách thành 6 phân đoạn (Hình 7) trong đó có 5 phân đoạn có hoạt tính protease được ký hiệu là FI, FII, FIII, FIV, và FV.. - Độ bền pH của protease trùn quắn. - Bảng 4: Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme ở các phân đoạn chạy qua cột sắc ký trao đổi ion. - Phân đoạn Hoạt tính tổng enzyme (U). - Độ tinh sạch của các phân đoạn enzyme sau khi qua cột sắc ký trao đổi ion đều tăng và hoạt tính của các phân đoạn được sắp theo thứ tự FV>FIV>FIII>FII>FI.. - Tổng hoạt tính của các phân đoạn protease thu được chiếm 47,42% hoạt tính tổng.. - Phân đoạn FV có hoạt tính cao nhất chiếm 30,08% hoạt tính tổng. - Các phân đoạn FI, FII, FIII, FIV, FV được rửa giải lần lượt ở các nồng độ muối 0,11. - So sánh với nghiên cứu tinh sạch protease trùn quế (Perionyx excavatus) (Nguyễn Thị Xuân Uyên, 2006) dung dịch trùn quế thô qua cột trao đổi ion gồm 4 phân đoạn có hoạt tính được rửa giải ở nồng độ muối NaCl từ 0,22-0,35M cao hơn so với trùn quắn là 0,11-0,31 M NaCl, nên nếu thay đổi gradient nồng độ muối thấp hơn thì khả năng tách sẽ tốt hơn các phân đoạn đối với trùn quắn khi qua cột trao đổi ion.. - Phổ diện điện di nhuộm hoạt tính (Hình 8) thể hiện hoạt tính protease của các phân đoạn sau khi qua cột trao đổi ion. - Trong phân đoạn FI (giếng 3) có một băng protein thể hiện hoạt tính với trọng lượng phân tử là 58,3kDa. - Trong phân đoạn FII (giếng 4) có 2 băng protein có hoạt tính với trọng lượng phân tử 25,5kDa và 46,7kDa. - Phân đoạn FIII (giếng 5) có 3 băng protein thể hiện rõ hoạt tính với trọng lượng là 24,1kDa . - Trong phân đoạn FIV (giếng 6) có 2 băng protein thể hiện rõ hoạt tính với trọng lượng là 27,4kDa. - Phân đoạn FV (giếng 7) có 3 băng protein có hoạt tính với trọng lượng lần lượt là 24kDa, 26kDa;. - Hình 8 : Phổ diện điện di SDS-PAGE nhuộm hoạt tính các phân đoạn protein sau khi qua cột trao đổi ion (không có -mercaptoethanol). - với protease trùn Lumbricus rubellus (Cho I., 2004), và protease trùn quế Perionyx excavatus (Uyên, 2006) với 4 phân đoạn enzyme gồm 7 băng protein thể hiện hoạt tính với casein có trọng lượng phân tử từ 15,8 đến 44,6kDa.. - Phân đoạn FI. - Phân đoạn FII. - Phân đoạn FIII. - Phân đoạn FIV. - Phân đoạn FV. - 3.3.3 Sắc ký tương tác kỵ nước các phân đoạn FI, FII, FIII, FIV và FV. - Do các phân đoạn protease nhận được sau khi qua cột trao đổi ion chưa được tinh sạch hoàn toàn nên chúng được tiếp tục cho qua cột tương tác kỵ nước Phenyl Sepharose.. - (a) Phân đoạn FI. - Phổ sắc ký của phân đoạn FI (Hình 9-A) chỉ có một đỉnh protein (FI-1) với hoạt tính là 1,559(U/mg). - Phân đoạn này được rửa giải ở nồng độ 5,5% ammonium sulfate bão hoà. - Kết quả so sánh với gel nhuộm hoạt tính (giếng 2, hình 8) cho thấy phân đoạn F1 có thể hoàn toàn tinh sạch được sau khi qua gel tương tác kỵ nước Phenyl Sepharose.. - (b) Phân đoạn FII. - Phân đoạn FII cũng chỉ 1 đỉnh protein (FII-1) (Hình 9-B) là có hoạt tính (1,222U/mg) và được rửa giải ở nồng độ 5% ammonium sulfate bão hoà. - Trên điện di SDS-PAGE với sự hiện diện của chất khử là β-mercaptoethanol phân đoạn enzyem này có trọng lượng phân tử là 25,5kDa. - Băng enzyme với trọng lượng phân tử 45,5kDa như trong gel nhuộm hoạt tính không tìm thấy. - Có khả năng đây là dạng dimer do hiện tượng kết dính của hai phân tử enzyme qua các cầu nối disulfit, trong điện di nhuộm hoạt tính do không có chất khử nên có thể phát hiện được.. - (c) Phân đoạn FIII. - Phổ sắc ký của phân đoạn FIII khá phức tạp, có tất cả thành 6 đỉnh protein (Hình 9-C), trong đó chỉ có 3 đỉnh có hoạt tính cao FIII-1 (1,667 U/mg), FIII-2 (2,041 U/mg), FIII-3 (1,375 U/mg) và được rửa giải ở nồng độ 2,5%, và 0% amonium sulfate bão hoà. - Các phân đoạn protease này cũng tương ứng với thành phần. - Hình 9: Phổ sắc ký của các phân đoạn qua cột Phenyl Sepharose. - (A) Phân đoạn FI (B) Phân đoạn FII (C) Phân đoạn FIII (D) Phân đoạn FIV (E) Phân đoạn FV. - (d) Phân đoạn FIV. - Phân đoạn FIV trên cột tương tác kỵ nước có 3 đỉnh protein khác nhau (Hình 9-D), trong đó chỉ có 2 đỉnh có hoạt tính là FIV-1 (0,802 U/mg), FIV-2 (1,343 U/mg), được rửa giải ở nồng độ 2,5% và 0,0% ammonium sulfate bão hoà.. - (e) Phân đoạn FV. - Tương tự như phân đoạn F3, phân đoạn FV có 6 đỉnh protein (Hình 9-E), trong đó chỉ có 3 đỉnh là có hoạt tính FV-1 (0,705 U/mg), FV-2 (0,903 U/mg), FV-3 (0,843 U/mg) và được rửa giải ở nồng độ tương ứng là ammonium sulfate bão hòa.. - Có thể thấy các phân đoạn enzyme nhận được qua sắc ký trao đổi ion đã được phân tách tiếp tục trên cột sắc kí tương tác kỵ nước, và các thành phần enzyme này tương ứng với kết quả điện di nhuộm hoạt tính trên SDS-PAGE. - Tuy nhiên, các phân đoạn enzyme được rửa giải ở các nồng độ muối bão hòa khá thấp, cao nhất ở 9% và thấp nhất ở 0%. - Phân đoạn. - Để có dung dịch enzyme với hoạt tính tối đa cần thiết phải tiến hành quá trình tự thủy phân protease của trùn quắn trong 4 ngày.. - Tủa acetone kết hợp với sắc ký trao đổi ion và sắc ký tương tác kỵ nước có thể tinh sạch được các thành phần protease trong trùn quắn, có tất cả khoảng 10 phân đoạn enzyme khác nhau với trọng lượng phân tử từ 24,0 kDa đến 58,3 kDa.. - Trong các nghiên cứu sau này cần khảo sát cụ thể một số tính chất của từng phân đoạn enzyme như nhiệt độ và pH tối ưu. - So sánh hoạt tính trên đĩa fibrin, chọn ra phân đoạn enzyme có hoạt tính mạnh và độ tinh sạch cao để có thể ứng dụng trong y dược học.. - Hoạt tính thủy phân fibrin của enzyme tách từ một số loài giun đất Việt nam