- TỐI ƯU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH ENZYME PROTEASE NGOẠI BÀO CỦA VI KHUẨN Streptomyces DH3.4. - Nghiên cứu được thực hiện trong điều kiện in vitro nhằm đánh giá sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên hoạt tính enzyme protease của vi khuẩn Streptomyces DH3.4. - Thí nghiệm thực hiện ở các môi trường pH khác nhau 4. - 8 và 9, nồng độ NaCl 0. - Thời gian quan sát trong thí nghiệm là và 168 giờ. - Nguồn carbohydrate sử dụng trong thí nghiệm là glycerol, D- glucose, sucrose, D-maltose, D-xylose, soluble starch với nồng độ 1%.. - Thí nghiệm đươc bố trí với 3 lần lặp lại. - Kết quả cho thấy khả năng sinh hoạt tính protease cao nhất của chủng Streptomyces DH3.4 được ghi nhận ở điều kiện nuôi cấy pH 7,0. - cereus, Streptomyces rimosus và Aspergillus oryzae… Trong đó, enzyme protease được sản xuất với sản lượng lớn nhất chủ yếu từ vi khuẩn Bacillus mặc dù có nhiều nguồn vi khuẩn để sản xuất protease nhưng chỉ có một số ít được nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất thương mại. - Về phương diện tổng hợp protease, Streptomyces được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn Bacillus và nấm mốc. - terimosus,… Các chế phẩm protease từ vi khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được chiết tách từ Streptomyces grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân hơn 90%. - Vi khuẩn Streptomyces có khả năng tiết ra enzyme protease ngoại bào và có thể được nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp để tạo ra các sản phẩm với các đặc tính ổn định trong các điều kiện môi trường khác nhau. - Trên cơ sở đó các nghiên cứu được tiến hành để thu được nguồn protase có hàm lượng hoạt tính cao cần tối ưu từ nguồn phân lập, phương pháp thực hiện, điều kiện nuôi cấy, đặc biệt là thành phần và cơ chất cảm ứng trong môi trường nuôi. - Do đó thí nghiệm được tiến hành nhằm tối ưu các điều kiện nuôi cấy trong in vitro lên khả năng sinh enzyme protease của chủng vi khuẩn Streptomyces DH 3.4.. - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. - Phương pháp nghiên cứu 2.1.1. - Đối tượng thí nghiệm. - Chủng vi khuẩn Streptomyces DH3.4 được phân lập từ bùn ao nuôi tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei ở tỉnh Trà Vinh với hoạt tính kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus và hoạt tính enzyme cao (Phạm Văn Nhuần, 2020) và bảo quản tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật hữu ích, Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.. - Phương pháp chuẩn bị bào tử vi khuẩn Chủng vi khuẩn Streptomyces DH3.4 được phục hồi và nuôi trên môi trường starch casein agar. - (SCA) ở 30 o C trong 5 ngày đến khi bào tử vi khuẩn xuất hiện. - Hút 3 mL nước muối sinh lý tiệt trùng (0,9% NaCl) và 1 giọt dung dịch 0,1% Tween 80 (chất hoạt động bề mặt) vào đĩa SCA chứa bào tử vi khuẩn Streptomyces (El-Shatoury et al., 2020), sau đó dùng que cấy khử trùng tách nhẹ nhàng các bào tử trên khuẩn lạc vào dung dịch trên và hút chuyển vào ống nghiệm tiệt trùng. - Paul, 1992) bằng nước muối sinh lý tiệt trùng và mật độ vi khuẩn Streptomyces sp. - Tối ưu pH của môi trường. - Ảnh hưởng nồng độ NaCl. - Thí nghiệm nhằm đánh giá ảnh hưởng của các nồng độ NaCl lên hoạt tính enzyme của chủng vi khuẩn. - Phần dịch CFS và sinh khối tế bào được thu bằng phương pháp ly tâm để xác định hoạt tính enzyme và trọng lượng khô. - Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại.. - Ảnh hưởng của các nguồn carbohydrate Nguồn carbohydrate (C) sử dụng trong thí nghiệm bao gồm glycerol, d-glucose, sucrose, d- maltose, d-xylose, soluble starch được bổ sung vào. - môi trường SCB với nồng độ 1% (Al-Dhabi et al., 2020b) và 100 µL huyền phù bào tử vào ống nghiệm đã bổ sung các nguồn C thay thế. - Thí nghiệm được lặp lại với 3 lần. - Hoạt tính enzyme và trọng lượng khô của tế bào được xác định sau 5 ngày nuôi cấy ở 30℃ trên máy lắc (tốc độ 150 vòng/phút).. - Ảnh hưởng của các nguồn nitrogen. - Thí nghiệm được thực hiện tương tự như phương pháp mô tả ở trên với 2 nguồn nitrogen (N) hữu cơ và vô cơ. - Nguồn N vô cơ: môi trường SCB được bổ sung lần lượt các nguồn KNO 3 , (NH 4 NO 3. - Ống nghiệm chứa môi trường SCB đã điều chỉnh các nguồn N khác nhau được bổ sung 100 µL huyền phù bào tử và đánh giá hoạt tính protease sau 5 ngày nuôi cấy ở 30℃ trên máy lắc (tốc độ 150 vòng/phút). - Các nghiệm thức trong thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện in vitro với 3 lần lặp lại.. - Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính enzyme protease. - Hoạt tính enzyme của chủng vi khuẩn Streptomyces DH3.4 được đánh giá ở các mốc thời gian nuôi cấy khác nhau. - Hoạt tính enzyme và trọng lượng khô của tế bào được xác định sau và 168 giờ nuôi (Akhtar et al., 2013) ở 30℃ trên máy lắc (tốc độ 150 vòng/phút). - Đánh giá hoạt tính enzyme protease ngoại bào. - Ly trích enzyme: Sau 5 ngày nuôi cấy, ly tâm huyền phù ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4℃ để loại bỏ tế bào vi khuẩn và thu phần dịch nổi phía trên để xác định hoạt tính enzyme protease (Fernandes et al. - Hoạt tính protease được xác định dựa theo phương pháp Lowry được mô tả bởi Huynh et al.. - Sau 30 phút, hỗn hợp trên được ly tâm ở tốc độ 8000 rpm trong 5 phút ở 4℃ và thu phần dịch nổi bên trên để xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Lowry et al. - Mỗi đơn vị (Unit) hoạt tính enzyme protease tương đương với lượng enzyme cần thiết để phân giải casein và phóng thích 1 µg tyrosine/mL/phút.. - Phương pháp xác định trọng lượng khô: Sinh khối tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp trọng lượng theo mô tả trước đây của van Veen and Paul (1979), cụ thể là 10 mL huyền phù vi khuẩn Streptomyces DH3.4 ở độ pha loãng với các . - Ảnh hưởng của pH. - Trong thí nghiệm đánh giá khả năng sinh hoạt tính enzyme protease từ Streptomyces DH3.4 bằng phương pháp nuôi cấy chìm, pH môi trường có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng hoạt tính protease thu được do vi khuẩn sinh ra trong quá trình nuôi cấy.. - Tùy vào giá trị pH khác nhau sẽ thu được hoạt tính protease ở các giá trị khác nhau. - Kết quả (Hình 1) cho thấy hoạt tính enzyme protease cao ở pH 6, 7 và 8. - Tuy nhiên ở pH U/mg) hoạt tính ezyme protease đạt giá trị cao nhất và đạt giá trị thấp nhất ở pH U/mg) và khác biệt có ý nghĩa thống kê. - (2013), sản phẩm enzyme protease của Streptomyces tối ưu ở pH 7. - Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính protease. - Các ký tự khác nhau trên mỗi cột cho thấy sự khác biệt giữa các giá trị pH trong thí nghiệm (p<0,05).. - Ảnh hưởng của NaCl. - Nồng độ muối NaCl có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng và sinh enzyme protease ngoại bào. - Kết quả vi khuẩn Streptomyces DH3.4 được nuôi cấy trong môi trường SCB ở nồng độ 0. - nhiên, nồng độ NaCl thấp hơn 1% và cao hơn 2%, chúng vẫn có khả năng sinh hoạt tính enzyme protease ngoại bào nhưng hàm lượng hoạt tính enzyme protease thấp hơn NaCl. - Theo kết quả nghiên cứu của Jayasree et al. - (2009) trên loài Streptomyces pulvereceus, hoạt tính enzyme protease cao nhất ở nồng độ 1% NaCl. - Trong nghiên cứu hiện tại, chủng Streptomyces DH3.4 đạt hoạt tính cao nhất ở nồng độ 1,5% NaCl do chủng vi khuẩn được phân lập từ vùng nuôi tôm nước lợ.. - Ảnh hưởng nồng độ NaCl lên hoạt tính enzyme protease. - Các ký tự khác nhau trên mỗi cột cho thấy sự khác biệt giữa các nồng độ NaCl trong thí nghiệm (p<0,05).. - Ảnh hưởng nguồn carbohydrate Trong nghiên cứu này, khả năng sinh enzyme protease từ vi khuẩn Streptomyces DH3.4 cho thấy hoạt tính protease thu được hiệu quả nhất với glucose là U/mg và soluble starch U/mg trong đó soluble starch là cao nhất và nguồn carbon có hoạt tính enzyme protease thu được thấp nhất là sucrose U/mg) (Hình 3).. - Theo nghiên cứu của Al-Dhabi et al. - Al-Dhabi-82 sinh hoạt tính protease cao nhất với 1,5% maltose so với các nguồn carbon khác như glucose, lactose, fructose, tinh bột và trehalose. - Tuy nhiên, kết quả của thí nghiệm tương đồng với nghiên cứu của Nayera et al. - (2014) rằng tinh bột là nguồn carbon để tối ưu hoạt tính protease tiết ra bởi nhóm vi khuẩn Streptomyces sp.. - Ảnh hưởng nguồn Carbon lên hoạt tính enzyme protease. - Các ký tự khác nhau trên mỗi cột cho thấy sự khác biệt giữa các nồng độ Carbohydrate trong thí nghiệm (p<0,05).. - Ảnh hưởng nguồn nitrogen. - Kết quả cho thấy nguồn nitrogen hữu cơ cho enzyme với hoạt tính enzyme protease cao là malt extract và peptone. - Tuy nhiên malt extract là nguồn nitrogen hữu cơ cho hoạt tính. - enzyme protease cao nhất U/mg) cao hơn casein (47,1 ± 7 U/mg), tryptone U/mg), bã đậu nành U/mg), yeast extract (39,1. - Kết quả nghiên cứu của Haritha et al. - (2012) và kết quả của nghiên cứu này trái ngược với nhau, kết quả của Haritha cho thấy bã đậu nành là nguồn nitrogen hữu cơ sản sinh enzyme protease hoạt tính cao nhất và trong thí nghiệm này kết quả malt extract là nguồn N hữu cơ sinh enzyme protease cao nhất.. - Ảnh hưởng nguồn N hữu cơ lên hoạt tính enzyme protease. - Các ký tự khác nhau trên mỗi cột cho thấy sự khác biệt giữa các nguồn N hữu cơ trong thí nghiệm (p<0,05).. - Nguồn N vô cơ môi trường SCB được bổ sung lần lượt là KNO 3 , (NH 4 NO 3. - Kết quả cho thấy khi sử dụng nitrogen vô cơ hoạt tính enzyme protease thu được cao nhất lần lượt là (NH 4 )SO U/mg) và KNO U/mg), đạt hiệu quả hơn NH 4 NO 3. - (2012), kết quả thí nghiệm của ông và kết quả của thí nghiệm này tương đồng với nhau đều cho thấy (NH 4 ) 2 SO 4 là nguồn nitơ vô cơ sản sinh enzyme protease hoạt tính cao nhất trong khảo sát.. - Ảnh hưởng nguồn N vô cơ lên hoạt tính enzyme protease. - Các ký tự khác nhau trên mỗi cột cho thấy sự khác biệt giữa các nguồn N vô cơ trong thí nghiệm (p<0,05).. - Tùy vào đặc tính của từng loài vi khuẩn sử dụng trong quá trình thí nghiệm và điều kiện nuôi biểu hiện mà nhu cầu về các thành phần dinh dưỡng sẽ khác nhau trong quá trình sinh tổng hợp enzyme protease. - Và quá trình sinh tổng hợp enzyme protease từ chủng DH3.4 trong thí nghiệm này cho thấy nguồn N được sử dụng tốt là malt extractvà (NH 4 ) 2 SO 4 và KNO 3 . - Tuy nhiên, tùy mỗi chủng vi khuẩn Streptomyces sp. - Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính enzyme protease. - Hình 6 cho thấy hoạt tính enzyme protease có xu hướng tăng dần theo thời gian, đạt giá hoạt tính cao sau 96 giờ nuôi, đặc biệt sau 144 giờ U/mg) và khác biệt có ý nghĩa so với các mốc thời gian còn lại (p<0,05). - Trong khi đó, hoạt tính thấp nhất ghi nhận được sau 24 giờ nuôi (12,4 ± 4 U/mg).. - (2013), Streptomyces albolongus và Streptomyces aburaviensis sinh hoạt tính protease cao nhất sau 120 giờ nuôi và có xu hướng giảm dần theo thời gian.. - Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính enzyme protease. - Các ký tự khác nhau trên mỗi cột cho thấy sự khác biệt giữa các mốc thời gian trong thí nghiệm (p<0,05).. - Protease thu nhận từ chủng Streptomyces DH3.4 là enzyme protase ngoại bào được vi khuẩn tổng hợp và tiết ra trong quá trình sinh trưởng. - Mỗi thời điểm trong chu kỳ sinh trưởng vi khuẩn sẽ sinh tổng hợp enzyme với nồng độ và hoạt độ khác nhau. - Nếu thu nhận enzyme quá sớm, nồng độ và hoạt tính enzyme protease sẽ thấp. - Ngược lại, nếu kéo dài thời điểm thu nhận enzyme thì lượng enzyme tiết ra môi trường quá nhiều sẽ ảnh hưởng lẫn nhau và enzyme chịu tác động của các yếu tố môi trường bên ngoài sẽ làm giảm hoạt tính enzyme hay phá hủy cấu trúc tự nhiên của enzyme. - Do đó, khả năng sinh enzyme ngoại bào là một tiêu chí quan trọng khi chọn lọc các chủng vi khuẩn làm probiotic. - Hoạt tính enzyme protease thu nhận từ chủng Streptomyces DH3.4 cao nhất khi nuôi cấy in vitro trong môi trường SCB ở pH 7,0 và 1,5% NaCl trong 144 giờ nuôi cấy. - Nguồn carbon để thu hoạt tính protease cao nhất là tinh bột, trong khi đó malt extract và (NH 4 ) 2 SO 4 là nguồn đạm hữu cơ và vô cơ tốt nhất. - Tuy nhiên, những nghiên cứu về khả năng sản xuất và bảo quản enzyme protease ở quy mô lớn hơn cần phải được đánh giá trong các nghiên cứu tiếp theo.. - Khảo sát đặc tính probiotic các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long