TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG

- TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP PECTIN METHYLESTERASE TỪ Aspergillus niger BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG.
- Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định tác động của các điều kiện lên men bề mặt trên môi trường rắn đến quá trình tổng hợp pectin methylesterase.
- Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) gồm 4 thừa số với mô hình phức hợp tại tâm (CCD) được sử dụng để tối ưu hóa các điều kiện lên men tổng hợp pectin methylesterase (PME), bao gồm tỷ lệ bào tử nấm mốc - với sự kết hợp ở tỷ lệ 1:1 của 2 dòng Aspergillus niger được phân lập từ vỏ cam soàn (So 2 ) và vỏ bưởi Năm Roi (R 1 ) sử dụng, pH ban đầu, nhiệt độ ủ và độ ẩm môi trường lên men.
- Trong thí nghiệm này, môi trường lên men sử dụng cơ chất chính là bã táo ta khô và vỏ bưởi Năm Roi (tỷ lệ 1 :1 w/w) làm cơ chất lên men chính, có bổ sung 0,1% urea, 0,5%.
- Kết quả khảo sát cho thấy, hoạt tính PME đạt cao nhất U/g) sau 96 giờ ủ ở nhiệt độ 35,5C, pH ban đầu là 4,0 (điều chỉnh bằng đệm citrate), độ ẩm ban đầu là 57,4% và tỷ lệ huyền phù bào tử nấm ở mật số 10 5 cfu/mL sử dụng là 16,5% v/w (mL/g).
- Kết quả nghiên cứu đã chứng tỏ phương pháp bề mặt đáp ứng có thể ứng dụng để tìm ra điều kiện tối ưu của quá trình lên men giúp cải thiện tối đa hiệu quả tổng hợp pectin methylesterase..
- Nghiên cứu tuyển chọn dòng Aspergillus niger bản địa thích hợp cho quá trình tổng hợp và thu nhận PME tại chỗ đã được tiến hành trước đó (Tran et al., 2009.
- Tuy nhiên, để có thể nhân rộng và ứng dụng vào thực tiễn, việc tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme đặc thù là vấn đề được rất nhiều các nhà khoa học quan tâm..
- Để khắc phục những vấn đề này, việc sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) với mô hình phức hợp tại tâm (CCD) được áp dụng đã xác định mức độ tối ưu của các biến có ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp PME với số thí nghiệm vừa phải (Castilho et al., 2000).
- (2009) cũng đã bước đầu nghiên cứu tối ưu hóa quá trình lên men rắn sản xuất pectinase từ A..
- pH ban đầu của môi trường nhiệt độ lên men (25÷37°C) và tỷ lệ mốc sử dụng (2÷10.
- Kết quả cho thấy, mô hình bậc hai mở rộng đã được thiết lập để xác định ảnh hưởng tương tác của các điều kiện lên men đến hiệu suất thu nhận enzyme..
- Trong phạm vi nghiên cứu này, tương tác của các điều kiện lên men bề mặt trên môi trường rắn (bao gồm pH, độ ẩm môi trường, tỷ lệ huyền phù bào tử nấm và nhiệt độ ủ) đến quá trình tổng hợp pectin methylesterase từ dòng A.
- Cơ chất: Bã táo ta được ép tách loại nước (bằng cơ học) và được sấy ở nhiệt độ 601C đến độ ẩm 61% (thời gian sấy khoảng 3÷4 giờ).
- Vỏ bưởi Năm Roi chỉ lấy phần vỏ trắng bên trong, rửa sạch và cắt nhỏ khoảng 1 mm, tách bớt độ ẩm vỏ bưởi xuống còn 50% trước khi phối trộn (Tran et al., 2009)..
- 2.2 Tối ưu hóa điều kiện môi trường sinh tổng hợp PME.
- 2.2.1 Thành phần môi trường và dòng Aspergillus niger thích hợp.
- Thành phần môi trường lên men bề mặt trên môi trường rắn (SFF) sinh tổng hợp PME và dòng Aspergillus niger thích hợp dựa trên khảo sát của Tran et al.
- Bã táo ta khô và vỏ bưởi Năm Roi được trộn với tỉ lệ 1:1 là thành phần cơ chất lên men chính.
- Thành phần dinh dưỡng bổ sung vào môi trường lên men gồm sung 0,1% urea, 0,5%.
- niger R 1 và So 2 có nguồn gốc từ vỏ bưởi Năm Roi và vỏ cam soàn với tỷ lệ 1:1 (mật số huyền phù bào tử nấm là 10 5 cfu/mL) được lựa chọn trong nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rắn sinh tổng hợp PME có hiệu quả cao nhất..
- 2.2.2 Ảnh hưởng tương tác của các điều kiện lên men đến hiệu quả thu nhận PME.
- Mục đích của khảo sát là xây dựng phương trình hồi quy của các yếu tố tương tác gồm pH, độ ẩm ban đầu của môi trường, tỷ lệ huyền phù bào tử nấm bổ sung và nhiệt độ ủ đến quá trình sinh tổng hợp PME từ A.
- Dựa trên kết quả khảo sát ảnh hưởng riêng lẻ của tỷ lệ huyền phù bào tử nấm sử dụng, pH, độ ẩm và nhiệt độ ủ (Tran và Nguyen, 2010), tiến.
- hành tối ưu hóa các điều kiện lên men này theo phương pháp bề mặt đáp ứng với 4 nhân tố thay.
- Bảng 1: Giá trị mã hóa và giá trị thực của các nhân tố tương tác đến hiệu quả sinh tổng hợp PME (U/g).
- Tỷ lệ huyền phù bào tử nấm (10 5 cfu/mL) bổ sung X 1 (%v/w.
- pH ban đầu của môi trường X .
- Nhiệt độ ủ X 3 ( o C .
- Độ ẩm ban đầu của môi trường X 4.
- Tiến hành pha loãng cơ chất đến độ ẩm với các tỷ lệ khảo sát (X 4 ) ứng với các giá trị của pH (X 2 ) bằng dung dịch đệm citrate.
- Sau khi cấy nấm mốc với các tỷ lệ huyền phù bào tử nấm thay đổi (X 1.
- mẫu khảo sát được tiến hành lên men ở các tủ ủ có nhiệt độ khảo sát (X 3 ) tương ứng với thời gian lên men được cố định là 96 giờ (Tran và Nguyen, 2010)..
- Sử dụng dung dịch đệm citrate pH 3,6 để thu lấy dung dịch enzyme thô và canh trường sau lên men là 2:1.
- Quá trình trích ly tiến hành ở nhiệt độ 35 o C và thời gian 50 phút (Tran et al., 2009).
- Thu dịch chứa enzyme tương ứng với từng mức thời gian khảo sát để đo đạc hoạt tính PME có trong dịch trích..
- Từ hoạt tính của PME (U/g) tương ứng với các mẫu khảo sát, sử dụng chương trình Statgraphics Centurion 16,1 để phân tích tương tác của các nhân tố, xây dựng phương trình biểu thị hoạt tính PME.
- thu được trong mối tương quan của các thông số lên men.
- Vẽ đồ thị đường đồng điểm biểu diễn hoạt tính PME thu được dựa trên tương tác của 2 nhân tố và 2 nhân tố còn lại được giữ ở điểm trung tâm..
- Xác định các thông số tối ưu hóa của quá trình lên men..
- Nghiên cứu xác định hồi quy tương quan của 4 nhân tố, bao gồm tỷ lệ huyền phù bào tử nấm sử dụng X 1 (12÷20% v/w), pH ban đầu của môi trường X nhiệt độ ủ X 3 (28÷40C) và độ ẩm ban đầu môi trường X đến hoạt tính PME thu nhận (Y, U/g) được thực hiện.
- Bảng 2: Ảnh hưởng của các nhân tố mã hóa đối với phương trình hồi quy.
- Từ Bảng 2, tất cả giá trị P của các thừa số đều nhỏ hơn 0,05 đã chứng tỏ các nhân tố khảo sát đều ảnh hưởng đến quá trình lên men bề mặt trên môi trường SSF sinh tổng hợp PME từ A.
- các tương tác có ý nghĩa đến quá trình lên men được khảo sát..
- Dựa trên kết quả phân tích ANOVA, phương trình hồi quy thể hiện sự tương quan của điều kiện lên men đến hoạt tính PME thu nhận được thiết lập và sử dụng để dự đoán hiệu quả sinh tổng hợp PME.
- Hoạt tính PME mô phỏng (Y lý thuyết) được xác định bằng cách thay các biến với giá trị thực.
- Hoạt tính PME thu được từ thực nghiệm và tính toán theo phương trình có độ tương thích cao ở giá trị r = 0,9891 (Hình 1)..
- Hình 1: Đồ thị tương quan giữa hoạt tính PME xác định thực nghiệm và tính toán theo phương trình hồi quy.
- Hệ số tương quan cho biết 98,9% sự biến đổi hoạt tính PME là do ảnh hưởng của các biến độc lập X 1 , X 2 , X 3 và X 4 và chỉ có 1,1% sự thay đổi là do các yếu tố không xác định được gây ra..
- Hình 2: Đồ thị biểu diễn sự tương tác của cặp nhân tố đến hiệu quả thu nhận PME.
- Đồ thị tổng quát ở Hình 2 cho thấy, hầu hết các nhân tố đều có sự ảnh hưởng đồng thời đến quá trình tổng hợp enzyme.
- Tuy nhiên, ảnh hưởng đồng thời của việc điều chỉnh tỷ lệ huyền phù bào tử nấm bổ sung và pH ban đầu của môi trường lên men không mang lại hiệu quả sinh tổng hợp PME vượt trội, thể hiện ở đỉnh tối ưu nằm ở mức thấp.
- Ảnh hưởng đồng thời của việc điều chỉnh pH và các nhân tố khác như nhiệt độ ủ, độ ẩm ban đầu của môi trường lên men cũng không tạo nên hiệu quả thu nhận PME cao khi so sánh với các cặp tương tác của nhiệt độ ủ và độ ẩm hay tỷ lệ huyền phù bào tử nấm sử dụng (Hình 3, 4 và 5)..
- Hình 3: Đồ thị đường đồng điểm biểu diễn tương tác của tỷ lệ huyền phù bào tử.
- nấm và pH môi trường ban đầu đến hoạt tính PME thu nhận.
- Cố định nhiệt độ ủ 34C và độ ẩm môi trường 60%.
- Hình 4: Đồ thị đường đồng điểm biểu diễn tương quan của tỷ lệ huyền phù bào tử.
- nấm bổ sung và nhiệt độ ủ đến hoạt tính PME thu nhận Cố định độ ẩm và pH môi trường là 60% và 4,0.
- Hình 5: Đồ thị đường đồng điểm biểu diễn tương tác của tỷ lệ huyền phù bào tử nấm và độ ẩm môi trường ban đầu đến hoạt tính.
- PME thu nhận Cố định nhiệt độ ủ 34C và pH 4,0).
- Hình 6: Đồ thị đường đồng điểm biểu diễn tương tác của nhiệt độ ủ và.
- pH ban đầu của môi trường đến hoạt tính PME thu nhận Tỷ lệ huyền phù bào tử nấm 16% và độ ẩm 60%.
- Hình 7: Đồ thị đường đồng điểm biểu diễn tương tác của pH và độ ẩm ban đầu.
- của môi trường lên men đến hoạt tính PME thu nhận.
- Tỷ lệ huyền phù bào tử nấm 16%.
- nhiệt độ ủ 34C.
- Hình 8: Đồ thị đường đồng điểm biểu diễn tương tác giữa nhiệt độ ủ và độ ẩm ban đầu của môi trường lên men.
- đến hoạt tính PME thu nhận.
- Cố định tỷ lệ huyền phù bào tử nấm 16% và pH 4,0 Ở tỷ lệ huyền phù bào tử nấm mốc bổ sung thấp.
- việc điều chỉnh pH ban đầu của môi trường lên men ở mức cao (pH 5,0) cho hiệu suất cao hơn hẳn so với mức pH thấp (pH 3,0).
- Khi tỷ lệ huyền phù bào tử nấm mốc tăng đến khoảng 16÷17% thì hoạt tính PME thu được ứng với pH ban đầu cao nhất (5,0) hay thấp nhất (3,0) bằng nhau.
- Khi tăng tỷ lệ huyền phù nấm mốc lên đến 20% thì hoạt tính PME thu được có xu hướng cao hơn ở pH thấp (Hình 2a và 3)..
- Tương tự, khi cố định hai biến độ ẩm và pH ban đầu của môi trường ủ mốc (Hình 2b và 4), hoạt tính PME thu được thấp khi nhiệt độ môi trường ủ ở mức khảo sát thấp nhất (28°C.
- ngay cả ở tỷ lệ nấm mốc sử dụng cao và chỉ thể hiện hoạt tính ở điều kiện nhiệt độ thấp với lượng nấm mốc sử dụng vừa phải.
- Ngược lại, ở nhiệt độ ủ cao nhất, mức độ ẩm môi trường thấp cho hiệu quả thu nhận enzyme cao hơn trường hợp điều chỉnh ẩm ở mức cao..
- Nói cách khác, ở tỷ lệ huyền phù bào tử nấm bổ sung thấp, sự thay đổi nhiệt độ ủ không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính PME thu được.
- Điều này cũng xảy ra tương tự đối với sự ảnh hưởng đồng thời của độ ẩm và nấm mốc (Hình 2c và 5), pH và nhiệt độ (Hình 2d và 6), nhiệt độ và độ ẩm (Hình 2f và 8)..
- Ảnh hưởng đồng thời của độ ẩm và nấm mốc dẫn đến sự gia tăng hoạt tính PME cao hơn khi điều chỉnh tỷ lệ huyền phù bào tử nấm bổ sung về.
- Đặc biệt, độ ẩm thấp là điều kiện thích hợp hơn cho sự tạo thành PME ở tỷ lệ nấm mốc bổ sung gia tăng.
- Trong khi đó, nhiệt độ ủ tăng cao giúp sự tăng trưởng của nấm mốc tốt hơn, nhờ đó gia tăng khả năng tổng hợp enzyme.
- Điều kiện lên men sinh tổng hợp PME tối ưu ở khoảng trung bình của pH khảo sát, tuy nhiên nhiệt độ ủ thích hợp lại lệch dần về mức nhiệt độ cao.
- Mặc dù sự tác động của pH không cho hiệu quả thu nhận PME cao, tuy nhiên ở mức pH thấp, sự thay đổi nhiệt độ ủ hầu như không có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt động của nấm mốc và sự tổng hợp PME.
- Khi giá trị pH ban đầu của môi trường lên men tăng, hoạt tính PME thu được giảm dần ở nhiệt độ thấp.
- Đồ thị đường đồng điểm ở Hình 8 và đồ thị tương tác của hai yếu tố nhiệt độ và độ ẩm (Hình 2f) một lần nữa khẳng định, nhiệt độ ủ thích hợp lệch dần về mức cao (vượt hơn mức tâm 34C).
- Ở nhiệt độ ủ cao nhất (40C), độ ẩm môi trường cao có lẽ là nguyên nhân dẫn đến sự cộng hưởng về nhiệt độ do sự bốc hơi nước dẫn đến trở ngại về điều kiện phù hợp cho sự tổng hợp enzyme, đồng thời độ ẩm và nhiệt độ cao sẽ thúc đẩy sự tăng trưởng nấm mốc nhiều hơn sự tích lũy PME, dẫn đến hiệu quả thu nhận PME thấp hơn khi độ ẩm tăng cao cùng với sự gia tăng nhiệt độ (Suresh et al., 2009).
- niger ở cả hai phương thức lên men lỏng (SmF) và SSF là 34C.
- Mặc dù vậy, nhiệt độ thích hợp cho quá trình.
- sinh tổng hợp PME cũng thay đổi tùy thuộc vào dòng vi sinh vật sử dụng, và ngay cả điều kiện khí hậu bên ngoài.
- (2008) đã đề xuất nhiệt độ ủ 37C là điều kiện thích hợp khi nuôi cấy Bacillus firmus – I – 4071, sinh tổng hợp pectinase..
- Trong khi đó, rất nhiều các nghiên cứu sinh tổng hợp pectinase nói chung và PME nói riêng lại tìm ra mức nhiệt độ tối ưu là 30C và 31C (Boccas et al., 1994.
- Cuối cùng, ảnh hưởng đồng thời của độ ẩm và pH (Hình 2e và 7) lại tạo sự biến thiên ngược khi so sánh với các cặp tương tác khác.
- Ở giá trị pH cao (5,0), sự thay đổi độ ẩm môi trường nuôi ủ hầu như không có ảnh hưởng đến hiệu quả thu nhận enzyme..
- Nhìn chung, các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm, pH và tỷ lệ nấm mốc không chỉ thể hiện ảnh hưởng bậc 1 và bậc 2 đến hiệu quả thu nhận enzyme mà còn chịu sự ảnh hưởng đồng thời của từng cặp nhân tố đến khả năng tổng hợp PME..
- Từ phương trình (1) cho thấy, điều kiện tối ưu để đạt được hoạt tính PME cao nhất (98,9%) như sau: Tỷ lệ huyền phù bào tử nấm A.
- niger (10 5 cfu/mL) sử dụng là 16,5% ở nhiệt độ ủ 35,5°C và pH cũng như độ ẩm ban đầu của môi trường lên men lần lượt là 4,0 và 57,4%.
- Hoạt tính PME được mô phỏng theo điều kiện lên men tối ưu là 66 U/g..
- Từ kết quả này, quá trình lên men SSF sinh tổng hợp PME từ A.
- niger So 2 và R 1 dưới điều kiện lên men tối ưu được tiến hành với hoạt tính enzyme ở điều kiện thực nghiệm (3 lần lặp lại) là 65,6±3,14 U/g..
- Kết quả nghiên cứu tìm ra được điều kiện lên men sinh tổng hợp PME được mô hình hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng với mô hình phức hợp tại tâm.
- Các thông số tối ưu của quá trình lên men được xác định gồm độ ẩm ban đầu 57,4%, pH 4,0 (điều chỉnh bằng citrate), nhiệt độ 35,5°C, tỷ lệ huyền phù bào tử nấm 16,5% v/w, thời gian ủ: 96 giờ