- TRÍCH LY ENZYME BROMELAIN TỪ PHẾ PHẨM KHÓM CẦU ĐÚC-HẬU GIANG Nguyễn Văn Thành 1 , Nguyễn Minh Thủy 2 , Lê Hà Ny 3 và Lê Trung Hiếu 4. - Bromelain thân, kết tủa sulfate ammonium, phế phẩm khóm Cầu Đúc- Hậu Giang, sấy chân không. - Ammonium sulfate. - Tách chiết enzyme bromelain từ phế phẩm khóm trong công nghiệp chế biến thực phẩm để chuyển chúng từ phế phẩm thành sản phẩm có giá trị, mặt khác cũng nhằm làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường. - Với mục tiêu trên, trong nghiên cứu này các tác nhân ảnh hưởng đến trích ly và bảo quản enzyme bromelain đã được khảo sát. - Kết quả nghiên cứu cho thấy trong số những phần phế phẩm (thân, lá, trái) thân khóm là nguồn cơ chất thích hợp để sản xuất enzyme bromelain. - Chế phẩm bromelain được kết tủa với ammonium sulfate 70%, ở nhiệt độ 28 o C, cho sản lượng 69,52%. - Bột enzyme thu được nên bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4 o C) trong chai thủy tinh, có hoạt tính ổn định trong 12 tuần.. - Từ đây cho thấy rằng việc sản xuất khóm tạo ra một nguồn phế phụ phẩm rất lớn có chứa enzyme bromelain. - 2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thí nghiệm 1: Thử nghiệm sơ bộ trích ly enzyme bromelain từ các nguồn phụ phế phẩm (thân, lá và trái). - Xác định hoạt tính và hàm lượng protein từ dịch trong thu được bằng phương pháp Kunitz (1974) cải tiến và phương pháp Bradford (1976).. - Từ đó chọn ra nguồn nguyên liệu cho hiệu suất và hoạt tính tối ưu để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.. - Hoạt tính tổng của enzyme bromelain (TU) bằng phương pháp Kunitz cải tiến.. - Hoạt tính riêng (TU/mg protein).. - 2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ammonium sulfate (SA) và nhiệt độ kết tủa. - Nhiệt độ kết tủa: nhiệt độ thường (28 o C) và. - Thực hiện thí nghiệm: nguyên liệu được nghiền ép, lọc bỏ bã thu dịch lọc, ly tâm lạnh 15000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 8 o C và thu dịch ly tâm. - Sau đó, cho tác nhân kết tủa vào với các nồng độ như đã bố trí thí nghiệm. - Sấy khô tủa và thu hồi chế phẩm enzyme bromelain thô.. - Sau khi chọn được nồng độ tác nhân kết tủa và nhiệt độ kết tủa từ thí nghiệm 1, thực hiện khảo sát ảnh hưởng của phương thức sấy đến hoạt tính riêng và hiệu suất thu hồi hoạt tính bromelain thô. - Tủa thu được đưa vào quá trình sấy theo các phương pháp đã được đề cập ở trên và thu hồi enzyme bromelain thô.. - 2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện bảo quản chế phẩm enzyme bromelain thô. - Nhiệt độ bảo quản: nhiệt độ phòng (25 o C), 4 o C và -20 o C.. - Cân mỗi mẫu khoảng 2 g bột cho vào túi PE và 2 g bột cho vào chai thủy tinh đủ để xác định hoạt tính trong 3 tháng (12 tuần). - Bảo quản trong điều kiện tránh sáng ở các nhiệt độ và xác định hoạt tính enzyme sau hai tuần bảo quản.. - Lượng enzyme bromelain thô thu được (mg/ml) (sử dụng cân điện tử độ chính xác 0,0001 g).. - Hoạt tính riêng của enzyme bằng phương pháp Kunitz (1974) cải tiến.. - Hiệu suất thu hồi enzyme bromelain. - Hiệu suất thu hồi hoạt tính tổng enzyme bromelain. - 3.1 Chất lượng và khối lượng enzyme bromelain trích ly từ các nguồn phế phẩm khóm. - Sự khác biệt hoạt tính và hàm lượng protein của enzyme bromelain từ các nguồn phế phẩm khóm được thể hiện ở Bảng 1.. - Hoạt tính tổng (TU). - Hoạt tính riêng (TU/mg). - Kết quả cho thấy thân khóm có hoạt tính tổng (4787,1 TU) và hoạt tính riêng (13,378 TU/mg) của enzyme bromelain là cao nhất, tiếp đó là ở trái (1191,4 TU. - (2004) và Nguyễn Đức Lượng (2004) về hoạt tính đặc hiệu của bromelain trái và thân trên cơ chất casein, cho thấy bromelain thân cao hơn bromelain trái. - Vì thế thân và trái có thể sử dụng để trích ly enzyme bromelain. - Enzyme bromelain ở thân và trái có điểm khác nhau, có lẽ do được cấu thành từ hai nhóm protein khác nhau (Ota et al., 1985). - Như vậy thân khóm là nguồn thích hợp cho trích ly enzyme bromelain thương mại có giá trị kinh tế cao.. - 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ tác nhân kết tủa ammonium sulfate và nhiệt độ kết tủa đến chất lượng và khối lượng bột enzyme bromelain. - 3.2.1 Nồng độ tác nhân kết tủa. - Sự kết tủa bromelain dưới tác dụng muối kiềm cho thấy ảnh hưởng của các nồng độ ammonium sulfate (từ 60÷80%) đến sự kết tủa enzyme bromelain (Bảng 2 và 3).. - Ở nghiệm thức 70% ammonium sulfate (SA) cho kết quả hoạt tính riêng và hiệu suất thu hồi hoạt tính tổng là tốt nhất (12,36 TU/mg và 72,59%, tương ứng) và có sự khác biệt ý nghĩa (độ tin cậy 95%) so với nghiệm thức 60% SA (hoạt tính riêng và hiệu suất thu hồi hoạt tính tổng là 11,83 TU/mg và 72,14%, tương ứng) và nghiệm thức 80% SA (11,35 TU/mg và 78,01%) ở nhiệt độ 28 o C.. - Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ muối ammonium sulfate ở nhiệt độ 28 o C đến sự kết tủa enzyme bromelain. - HSTH hoạt tính. - Hoạt tính riêng. - Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ muối ammonium sulfate ở nhiệt độ 4 o C đến sự kết tủa enzyme bromelain. - Khi thực hiện kết tủa ở 4 o C thì hoạt tính riêng của nghiệm thức 70% ammonium sulfate (13,09 TU/mg) thấp hơn có ý nghĩa so với nghiệm thức 60% SA (15,00 TU/mg) nhưng không khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức 80% SA (12,40 TU/mg). - Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi hoạt tính tổng ở nghiệm thức 70% SA (82,59%) cao hơn nghiệm thức 60% SA (68,33%) và nghiệm thức 80% SA (78,01. - (1994), khi kết tủa bromelain trái bằng ammonium sulfate ở các nồng độ từ 30 đến 100% cũng đã kết luận nồng độ 70% ammonium sulfate cho hiệu suất thu hồi hoạt tính cao nhất.. - (2002) đã nghiên cứu đánh giá các phương pháp trích ly bromelin từ nước khóm thô bằng aceton và ammonium sulfate đã kết luận rằng phương pháp trích ly bromelin bằng ammonium sulfate theo tỷ lệ 70% bão hòa thu nhận bromelain thô cho hiệu suất thu hồi khá cao 92% so với hoạt tính ban đầu. - 3.2.2 Nhiệt độ kết tủa. - Thực nghiệm cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng quan trọng đến quá trình trích ly bromelain (Bảng 4).. - Bảng 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự kết tủa enzyme bromelain Nhiệt độ. - o C) HSTH hoạt tính. - (TU/mg) Hoạt tính TU/g enzyme. - Kết quả cho thấy khi kết tủa ở nhiệt độ 28 o C thì hoạt tính riêng và hiệu suất thu hồi hoạt tính bromelain là 12,36 TU/mg và 72,59%, tương ứng, thấp hơn có ý nghĩa (độ tin cậy 95%) so với nghiệm thức kết tủa ở nhiệt độ 4 o C (hoạt tính riêng và hiệu suất thu hồi hoạt tính bromelain tương ứng là 13,09 TU/mg và 82,59. - Như vậy khi thực hiện kết tủa ở 4 o C với tác nhân tủa ammonium sulfate thì hoạt tính của enzyme luôn luôn tốt hơn nhiệt độ 28 o C ở bất kỳ nồng độ muối nào. - Ở nhiệt độ lạnh (4 o C), quá trình kết tủa protein và khả năng hạn chế sự biến tính diễn ra tốt hơn. - Nhóm tác giả cũng cho thấy rằng muối ammonium sulfate sử dụng cho kết tủa bromelain cũng cho hoạt tính của chế phẩm trích ly ở nhiệt độ 4 o C thường cao hơn ở nhiệt độ 27 o C. - Tuy nhiên, nhìn chung khi ly trích ở nhiệt độ phòng (28 o C), hoạt tính tổng của enzyme giảm 10% so ly trích ở nhiệt độ 4 o C và vẫn ở mức chấp nhận được. - Mặt khác, từ thực nghiệm cho thấy quá trình kết tủa ở nhiệt độ 4 o C diễn ra khó khăn, đòi hỏi phải có thiết bị làm lạnh nên rất tốn kém và thao tác phức tạp nên chi phí sản xuất cao. - Như vậy, nhằm hoàn thiện phương pháp sử dụng muối ammonium sulfate làm tác nhân kết tủa bromelain từ thân khóm, có thể chọn nồng độ và nhiệt độ kết tủa tương ứng là 70%. - 3.3 Ảnh hưởng của phương thức sấy đến hoạt tính riêng, hiệu suất thu hồi hoạt tính và khối lượng bột enzyme bromelain. - Nhiệt độ sấy và thời gian sấy là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của chế phẩm enzyme thô. - Sấy ở nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzyme do protein bị biến tính. - Tuy nhiên, khi sấy ở nhiệt độ thấp thì thời gian sấy kéo dài và trong thời gian này với sự hiện diện của ẩm độ cao thì sự tự phân của các protease sẽ diễn ra làm enzyme bị mất hoạt tính. - Kết quả cho thấy khi sấy đông khô chế phẩm enzyme bromelain thô trong 12 giờ cho hiệu suất thu hồi hoạt tính và hoạt tính riêng của bột enzyme thô cao nhất (87,55% và 12,96 TU/mg, tương ứng) và thể hiện sự khác biệt ý nghĩa so với 3 nghiệm thức sấy còn lại (Bảng 5).. - Tuy nhiên, không có sự khác biệt ý nghĩa về hiệu suất thu hồi hoạt tính và hoạt tính riêng của bột enzyme thô giữa các phương thức: sấy chân không trong 24 giờ (72,02% và 12,23 TU/mg), sấy khí lạnh khô trong 48 giờ (69,52% và 12,29 TU/mg) và phương thức sấy phun với chất bảo vệ là mannitol 5% (Nguyễn Phú Thọ và Dương Thị Hương Giang, 2011) trong 1 giờ (40,82% và 11,51 TU/mg).. - Bảng 5: Ảnh hưởng phương thức sấy đến hoạt tính enzyme bromelain Phương thức sấy HSTH hoạt. - Hoạt tính riêng TU/mg. - Như vậy, hoạt tính enzyme ổn định nhất khi thực hiện sấy bằng phương pháp đông khô. - Nếu nhiệt độ thường dễ làm enzyme biến tính thì phương pháp đông khô giúp enzyme giữ được tính chất hóa lý và cả hoạt tính. - cho kết quả hoạt tính được giữ lại sau hai quá trình này là 96% và 73%, tương ứng.. - Tuy nhiên so với sấy đông khô, sấy chân không được tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiều (30 o C) nên hoạt tính của bromelain sau khi sấy thấp hơn. - Tuy nhiên khi so sánh giữa sấy chân không với phương pháp sấy bằng khí lạnh khô ở nhiệt độ 4 o C thì các giá trị thu nhận được không thể hiện sự khác biệt ý nghĩa (độ tin cậy 95. - Điều này có thể là do bromelain là một enzyme bền nhiệt trong khoảng nhiệt độ 50–. - 60 o C, nên ở nhiệt độ khoảng 30 o C vẫn giữ được hoạt tính tương đối tốt như ở nhiệt độ lạnh (4 o C).. - Khi sử dụng phương pháp sấy phun, hoạt tính enzyme biến tính khá nhiều do độ bền nhiệt của bromelain kém hơn papain. - Ở 70 o C, bromelain bị biến tính nhanh gấp 20 lần papain ở 75 o C, tuỳ thuộc cơ chất mà nhiệt độ tối ưu khác nhau (Nguyễn Trọng Cẩn et al., 1998).. - sấy ngắn nhất (1 giờ), dễ sản xuất ở quy mô công nghiệp tuy nhiên lượng enzyme thất thoát lớn và dễ mất hoạt tính do sấy ở nhiệt độ cao. - Như vậy, có thể chọn phương pháp chân không cho quá trình sấy bột enzyme bromelain thô cho thí nghiệm tiếp theo.. - 3.4 Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến sự biến đổi chất lượng enzyme bromelain thô. - Enzyme bromelain thô được bảo quản ở các nhiệt độ o C. - Kết quả xác định hoạt tính riêng của enzyme cho thấy ở nhiệt độ 25 o C, hoạt tính enzyme giảm nhanh nhất (19,9%) và giảm ít hơn đối với enzyme được bảo quản ở 4 o C (8,25%) và giảm ít nhất khi được bảo quản ở -20 o C (4,96%) trong bốn tháng bảo quản (Hình 2) có sự khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy 95% giữa các nhiệt độ này.. - Enzyme bromelain được bảo quản trong chai thủy tinh và bao PE. - Kết quả xác định hoạt tính riêng cho thấy enzyme bảo quản trong chai thủy tinh tốt hơn (hoạt tính 11,59 TU/mg) cao hơn (có ý nghĩa) so với hoạt tính enzyme chứa đựng trong bao PE (11,34 TU/mg) (Bảng 6).. - Khảo sát hoạt tính enzyme bromelain thành phẩm cho thấy hoạt tính tổng và hoạt tính riêng của lọai này cao hơn (2165,12 TU và 12,51 TU/mg) và thể hiện sự khác biệt ý nghĩa so với chế phẩm enzyme bromelain thương mại (1929,1 TU và 7,01 TU/mg) (Bảng 7).. - Hình 2: Biến đổi tính đặc hiệu của bromelain theo nhiệt độ và thời gian bảo quản Bảng 6: Ảnh hưởng của dụng cụ chứa đến hoạt. - tính enzyme trong quá trình bảo quản Dụng cụ chứa Hoạt tính (TU/mg). - Bảng 7: So sánh hoạt tính của bột enzyme thành phẩm và bột enzyme thương mại Loại bột. - Hoạt tính riêng (TU/mg) Bột enzyme thành. - Kết quả thu nhận được từ nghiên cứu cho thấy thân khóm là nguồn nguyên liệu thích hợp để trích ly bột enzyme bromelain. - Có thể thực hiện tốt quá trình kết tủa enzyme bromelain bằng ammonium sulfate 70% ở 28 o C. - Hiệu suất thu hồi enzyme tốt nhất với phương thức sấy chân không trong 24 giờ, chế phẩm có màu trắng ngà, hiệu suất thu hồi hoạt tính tổng là 69,52%, hoạt lực 12,29 (TU/mg) và độ ẩm 1,87%. - Bột enzyme thành phẩm cần bảo quản trong chai thủy tinh ở nhiệt độ lạnh (khoảng 4 o C).. - Quy trình trích ly chế phẩm enzyme bromelain theo phương pháp kết tủa bằng ammonium sulfate được đề nghị sau:. - Kết tủa bằng ammonium sulfate 70%. - Bảo quản trong chai thủy tinh ở 4 o C Hình 3: Quy trình trích ly enzyme bromelain từ. - Nghiên cứu tách và tạo chế phẩm enzyme bromelain từ phế phụ phẩm dứa, Tạp chí Khoa học và Phát triển năm 2009 - tập 7, số Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.. - Nghiên cứu và sản xuất enzyme bromelain