- TƯƠNG QUAN GIỮA HÀM LƯỢNG ACID ACETIC SINH RA VÀ ETHANOL, ĐƯỜNG, MẬT SỐ VI KHUẨN A. - Giấm có thể được sản xuất từ nguyên liệu có đường và tinh bột, là chất nền cho quá trình lên men tạo rượu và tiếp theo là quá trình lên men tạo acid acetic. - Vi khuẩn lên men giấm (vi khuẩn acid acetic) là giống Acetobacter với đặc tính chuyển đổi rượu ethylic (C 2 H 5 OH) thành acid acetic (CH 3 CO 2 H) bởi quá trình oxy hóa. - Trong nghiên cứu này, giấm được sản xuất từ chuối với việc kiểm soát các thông số ảnh hưởng chủ yếu đến khả năng tạo acid acetic, bao gồm nồng độ rượu (59% v/v), nồng độ đường (075 g/L) và mật số vi khuẩn A. - Phương pháp mô hình bề mặt đáp ứng được chọn nhằm tối ưu hóa các thông số của tiến trình như hàm lượng rượu, đường và mật số tế bào vi khuẩn cho quá trình lên men giấm vang chuối. - Tương quan giữa hàm lượng acid acetic thực nghiệm và tính toán theo phương trình được tìm thấy (R 2 =0,97). - Giấm chuối đạt hàm lượng acid acetic cao (4%) khi lên men trong thời gian 6 tuần ở nhiệt độ phòng (37-38 o C) với dịch lên men chứa 5% ethanol, hàm lượng đường 20,62 g/L và mật số vi khuẩn 10 5 tế bào/mL.. - Giấm được sản xuất từ nguyên liệu có nguồn gốc nông nghiệp phù hợp, có chứa tinh bột, đường hoặc cả tinh bột và đường do quá trình lên men đôi, tạo cồn và acid acetic. - Quá trình lên men giấm cơ bản là quá trình hai giai đoạn với giai đoạn đầu tiên là chuyển đổi kỵ khí các loại đường lên men thành ethanol bằng nấm men, sử dụng loài Saccharomyces, và thứ hai là quá trình oxy hóa hiếu khí ethanol do vi khuẩn, thường loài Acetobacter (Horiuchi et al., 2000). - Vi khuẩn giấm, còn gọi là vi khuẩn acid acetic, là thành viên của chi Acetobacter với đặc điểm chuyển đổi ethyl alcohol, C 2 H 5 OH thành acid acetic. - Theo FDA (Food and Drug Administration, Hoa Kỳ), giấm chứa không ít hơn 4 gram acid acetic trong 100 ml ở 20°C, có thể áp dụng biện pháp lọc, chưng cất và thanh trùng ở 74°C trước khi đóng chai.. - Nguyên liệu sử dụng lên men giấm thường là rượu gạo, rượu vang, và các sản phẩm có cồn khác.. - Hiện chỉ có khoảng 10% sản lượng acid acetic trên thế giới được sản xuất theo phương pháp sinh học (Awad et al., 2012) nhưng phương pháp này vẫn được xem là quan trọng vì qui định ở nhiều quốc gia và của tổ chức FAO rằng giấm sử dụng trong thực phẩm phải có nguồn gốc sinh học (lên men) (Zahoor et al., 2006).. - Vì vậy, lên men tạo giấm từ chuối chín sẽ hạn chế tổn thất sau thu hoạch chuối, nâng cao hiệu quả kinh tế cho nhà vườn. - Lên men acetic là bước tiếp theo của quá trình lên men, trong đó các phân tử rượu được oxy hóa thành acid acetic do tác động của vi khuẩn Acetobacter aceti tạo hương vị dấm đặc trưng. - chuối, phương pháp này cũng được sử dụng để tối ưu hóa quá trình lên men tạo acid acetic từ vang chuối.. - Giống vi khuẩn: Acetobacter aceti ATCC 15973 (ATCC, Mỹ).. - Môi trường tăng sinh vi khuẩn: môi trường GYC (Glucose–Yeast extract–Calcium carbonate) (Benito, 2005).. - Chuối chín → Bóc vỏ → Chần→ Xay → Lọc→ Dịch quả → Phối chế → Thanh trùng → Lên men rượu → Phối chế → Lên men giấm → Lọc và thanh trùng → Sản phẩm.. - Lọc lấy dịch quả, điều chỉnh dịch lên men 18 o Brix và bổ sung nấm men để lên men rượu bằng phương pháp lên men tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 8 ngày. - Rượu sau khi kết thúc quá trình lên men được pha loãng ở các nồng độ từ 5 đến 9% (cách nhau 2%) và kiểm soát hàm lượng đường bổ sung theo các tỉ lệ từ 25 đến 75 g/L (cách nhau 25 g) cùng với mẫu không bổ sung đường.. - Các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm được phân tích bao gồm: hàm lượng ethanol. - v/v), độ Brix, và hàm lượng acid acetic. - 3.1 Tiến trình lên men tạo giấm từ chuối Rượu sau lên men đạt nồng độ 11. - v/v) được pha loãng 5%, bổ sung lượng đường 25 g/L để thực hiện quá trình oxi hóa ethanol thành acid acetic.. - Quá trình lên men khoảng 6 tuần. - Hình 1 biểu diễn sự tích tụ acid acetic và thay đổi hàm lượng ethanol, saccharose theo thời gian lên men. - Trong tuần đầu, khi đường được bổ sung vào môi trường lên men, vi khuẩn sử dụng hết đường để sinh trưởng và phát triển. - (2009), sự khởi đầu của quá trình hình thành acid acetic có liên quan đến sự tăng trưởng tối đa của tế bào và đủ sinh khối để bắt đầu quá trình chuyển hóa ethanol thành acid acetic. - Do đó, việc thay đổi môi trường ban đầu có ảnh hưởng đến các vi sinh vật lên men. - Nghiên cứu của Brock và Madigan (1991) cho thấy các vi sinh vật cần giai đoạn để thích ứng (pha log), tại thời điểm đó vi sinh vật hoạt động chưa mạnh nên hàm lượng acid sinh ra ít. - Ở pha lag, vi khuẩn có đủ năng lượng và được sử dụng để tổng hợp acid acetic. - Sự tiêu thụ hết hàm lượng ethanol 5% tương ứng với sự tăng dần hàm lượng acid acetic và đạt tối đa từ 0,3 đến 3,98% trong thời gian 6 tuần. - Vi khuẩn sử dụng chất nền ethanol để chuyển hóa thành sản phẩm trung gian acetaldehyde và cuối cùng thành acid acetic. - Quá trình lên men kết thúc ở tuần thứ 6 vì khi ethanol đã được sử dụng hết thì vi khuẩn tiếp tục thực hiện quá trình oxy hóa, sử dụng acid để chuyển hóa thành CO 2 và H 2 O làm giảm chất lượng của giấm.. - Thời gian lên men (tuần). - Hàm lượng acid. - Hàm lượng rượu còn lại. - v/v) Hàm lượng đường (g/L). - 3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng ethanol Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng ethanol đến hàm lượng acid sinh ra và các chỉ tiêu của sản phẩm trong quá trình lên men giấm ở 3 mức độ 5, 7 và 9% được thể hiện ở Bảng 1. - Tuy nhiên, để giữ được hương vị tự nhiên của sản phẩm giấm vang, rượu được sử dụng cho quá trình lên men giấm ở nghiên cứu này không qua thanh trùng, không bổ sung acid acetic để acid hóa môi trường. - Vì vậy, mặc dù trong quá trình lên men số lượng vi khuẩn acetic tăng nhưng ở giai đoạn đầu của quá trình lên men số lượng các vi sinh vật tạp. - Dữ liệu phân tích cho thấy với nồng độ rượu 7 và 9% thì ở giai đoạn đầu (pha lag) vi khuẩn A.aceti cần thời gian để thích nghi với môi trường, lượng acid sinh ra thấp, pH môi trường chưa giảm mạnh nên không đủ để ức chế hoạt động của nấm men, vì thế nấm men tiếp tục hoạt động làm cho nồng độ rượu tăng lên ức chế hoạt động của vi khuẩn A.aceti. - Ở hàm lượng ethanol ban đầu là 9% thì sau lên men lượng ethanol còn lại trên 10%. - (2006), ở nồng độ ethanol 10% vi khuẩn A.aceti không phát triển và acid sinh ra rất thấp.. - Bảng 1: Ảnh hưởng của hàm lượng ethanol đến các chỉ tiêu của sản phẩm Hàm lượng ethanol. - (2004), hàm lượng ethanol thích hợp cho quá trình lên men giấm là 6-15%. - Tuy nhiên, khả năng oxy hóa ethanol để tạo thành acid acetic của vi khuẩn acetic có sự thay đổi rất lớn giữa các giống, loài (Gullo and Giudici, 2008) và các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men như nhiệt độ, sự thoáng khí, phương pháp lên men. - Vì vậy, với hàm lượng ethanol sử dụng khoảng 7% thì hàm lượng acid acetic sinh ra cũng không cao, trung bình 0,8%. - Bên cạnh đó, lượng đường bổ sung ban đầu vào dịch lên men với hàm lượng ethanol 7 và 9%. - đã được sử dụng hết chính là do nấm men sử dụng đường để lên men rượu.. - Ngược lại với hàm lượng ethanol để lên men giấm là 5% thì lượng acid sinh ra rất cao do ở nồng độ rượu này vi khuẩn thích ứng nhanh với môi trường. - Nồng độ rượu thấp kích thích sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2004), acid sinh ra nhiều, pH giảm mạnh ức chế hoạt động của nấm men, do đó ở hàm lượng ethanol 5% thích hợp cho quá trình lên men giấm vang, hàm lượng acid sinh ra trung bình khoảng 2,75%. - Bấy giờ hàm lượng đường của dịch lên men cũng giảm nhanh do vi khuẩn sử dụng. - (trung bình 59,04%) và thể hiện sự khác biệt ý nghĩa so với hiệu suất lên men của các mẫu có nồng độ rượu 7 và 9%, tương ứng là 12,24 và 4,43%.. - 3.3 Ảnh hưởng của mật số vi khuẩn. - Trong tiến trình lên men giấm, vi khuẩn Acetobacter tham gia vào quá trình oxy hóa sinh học chuyển hóa ethanol thành acid acetic là do sự kết hợp của 2 enzyme là alcohol dehydrogenase (ADH) và aldehyde dehydrogenase (ALDH) (Valli et al., 2006). - Khi lên men giấm, tế bào nấm men bị ức chế và chết đi do sự hình thành acetaldehyde là sản phẩm đầu tiên của quá trình chuyển hóa rượu thành acid acetic và acetaldehyde cũng ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme của nấm men (Aranda and Delomo, 2003). - Kết quả thể hiện ở bảng 2 cho thấy với mật số vi khuẩn là 10 5 và 10 6 tế bào/mL thì hàm lượng acid acetic sinh ra nhiều và không thể hiện sự khác biệt ý nghĩa. - Tương tự, hàm lượng ethanol trong sản phẩm cũng không thể hiện sự khác biệt ý nghĩa giữa hai mức độ vi khuẩn sử dụng. - Trong khi đó với mật số vi khuẩn sử dụng cho tiến trình lên men là 10 4 tế bào/mL thì cho lượng acid sinh ra ít, pH môi trường chỉ giảm nhẹ không đủ để ức chế hoạt động của nấm men, làm. - Bảng 2: Ảnh hưởng của mật số vi khuẩn đến các chỉ tiêu của sản phẩm Mật số vi khuẩn. - Chỉ tiêu Hàm lượng acid. - Hàm lượng ethanol. - Dữ liệu phân tích thể hiện ở bảng 3 cho thấy đối với mẫu giấm có bổ sung đường 25 g/L cho lượng acid sinh ra cao hơn và có sự khác biệt so với các mẫu không bổ sung đường và các mẫu bổ sung đường hàm lượng 50 và 75 g/L.. - oxy hóa đường dễ dàng hơn ethanol, do đó Acetobacter có thể oxy hóa ethanol thành acid acetic mà không cần bổ sung đường. - Tuy nhiên, đường hiện diện trong quá trình lên men giấm cũng có ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của sản phẩm.. - Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến các chỉ tiêu của sản phẩm Hàm lượng đường. - Hiệu suất quá trình lên men cũng chịu ảnh hưởng của hàm lượng đường bổ sung. - Với hàm lượng đường sử dụng cho quá trình lên men là 25 g/L thì hiệu suất lên men cao nhất (trung bình 30,95. - trong khi các hàm lượng đường bổ sung khác (50 và 75g/L) hoặc không bổ sung đường thì hiệu suất quá trình lên men thấp hơn, các giá trị trung bình đạt được tương ứng là và 20,08%.. - 3.5 Tương tác giữa hàm lượng acid acetic sinh ra và các biến độc lập (hàm lượng rượu, hàm lượng đường và mật số vi khuẩn). - (2008) các chủng của chi Acetobacter giữ vai trò chủ yếu trong quá trình sản xuất giấm. - Vai trò quan trọng của vi khuẩn Acetobacter là khá rõ trong chuyển hóa ethanol thành acid acetic. - Ngoài ra, quá trình sản xuất giấm cũng cần lượng đường cho sự phát triển của vi khuẩn, tham gia vào quá trình sản xuất acid acetic (Gullo et al., 2005). - Do đó, nghiên cứu xác định mối tương quan của 3 nhân tố bao gồm hàm lượng ethanol (5÷9% v/v), hàm lượng đường bổ sung (25÷75g/L và mẫu đối chứng) và mật số vi khuẩn. - (10 4 đến 10 6 tế bào/mL) đến hàm lượng acid acetic sinh ra trong quá trình lên men giấm được thực hiện.. - Kết quả phân tích cho thấy sự tương thích của mô hình hồi quy đa chiều (phương trình 2) mô tả mối quan hệ giữa acid acetic sinh ra và 9 số hạng (3 biến độc lập là X 1 , X 2 , X 3. - Hàm lượng acid acetic. - Trong đó: X 1 là hàm lượng ethanol (5÷9% v/v), X 2 là hàm lượng đường bổ sung (25÷75 g/L) và X 3. - là mật số vi khuẩn (10 4 đến 10 6 tế bào/mL).. - Hệ số xác định tương quan R 2 theo thống kê chỉ ra rằng mô hình tương thích 96,425% biến thiên trong giá trị acid acetic thu nhận. - Phương trình 2 cũng cho thấy yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến quá trình tạo acid acetic chính là hàm lượng ethanol (X 1 ) sử dụng, kế đến là mật số vi khuẩn (X 3 ) và sau cùng là lượng đường (X 2. - Mức độ tương thích giữa hàm lượng acid acetic thực nghiệm và tính toán theo phương trình hồi quy 3 được tìm thấy (Hình 2) (R 2 = 0,96).. - HL acid acetic thực nghiệm. - HL acid acetic dự đoán. - Hình 2: Tương quan giữa nồng độ acid acetic. - Khi cố định hàm lượng đường bổ sung là 25 g/L, tương quan giữa hàm lượng acid acetic sinh ra và hàm lượng ethanol với mật số vi khuẩn được trình bày ở phương trình 4 và Hình 3.. - Trong quá trình lên men giấm, khi tăng hàm lượng ethanol từ 5 lên 9% thì lượng acid tạo thành. - men hoạt động trở lại và ức chế hoạt động của vi khuẩn.. - Ngược lại với hàm lượng ethanol, khi thực hiện tiến trình lên men acetic, việc bổ sung mật số vi khuẩn tăng dần từ 10 4 đến 10 6 (tế bào/mL) thì hàm lượng acid acetic tạo thành cũng tăng dần và đạt cao nhất ở mật số vi khuẩn từ 10 5 đến 10 6 (tế bào/mL) (không thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa).. - Điều này là do khi mật số vi khuẩn càng nhiều thì khả năng chuyển hóa ethanol thành acid acetic càng nhanh, pH môi trường giảm nhanh có thể ức. - Hình 3: Mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện tương quan giữa acid acetic, hàm lượng ethanol và mật số vi khuẩn trong quá trình lên men giấm vang chuối. - Mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện tương quan giữa hàm lượng acid sinh ra theo hàm lượng ethanol sử dụng và mật số vi khuẩn của chủng được thiết lập (Hình 3) (từ phương trình 4). - Đồng thời sử dụng chương trình STAGRAPHIC có thể dò tìm được các giá trị tối ưu cho quá trình lên men giấm vang chuối với hàm lượng acid acetic đạt được cao nhất (hàm lượng 4%) là: hàm lượng ethanol 5%, hàm lượng đường 20,62 g/L và mật số vi khuẩn 10 5 (tế bào/mL).. - Quá trình sản xuất giấm vang từ chuối già trong thời gian 43 ngày đạt 4% lượng acid acetic sinh ra.. - Thông số tối ưu cho quá trình lên men giấm là 5%. - ethanol trong dịch lên men, hàm lượng đường 20,62 g/L và mật số vi khuẩn là 10 5 tế bào/mL. - Từ kết quả này cho thấy cơ chất rượu ban đầu (ethanol) không qua thanh trùng, không acid hóa môi trường lên men giấm tạo được hương vị hài hòa, đặc trưng cho sản phẩm giấm vang.. - Các phương pháp phân tích ngành Công nghệ lên men