- TUYỂN CHỌN MOI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VA DỊNH DANH NẤM MEN PHAN LẬP TỪ NƯỚC THỐT NỐT THU. - Sử dụng nấm men thuần trong quá trình lên men rượu có thể nâng cao chất lượng rượu sản xuất ra. - Trên cơ sở các các dòng nấm men đã được phân lập từ nước thốt nốt thu hoạch ở Tịnh Biên, An Giang và với mục đích tuyển chọn môi trường dinh dưỡng và định danh nấm men, các thí nghiệm được thực hiện trên cơ sở khảo sát khả năng phát triển của các dòng nấm men được nuôi cấy trên ba môi trường dinh dưỡng Sabouraud, MEA (Malt Extract Agar) và PYGA (Khoai tây Glucose Agar có bổ sung Yeast Extract) và định danh ở mức độ giống các dòng nấm men phân lập. - Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường dinh dưỡng tổng hợp Sabouraud được sử dụng là thích hợp nhất để phân lập và nuôi cấy nấm men. - Dựa trên khóa phân loại nấm men, đã định danh được ba giống nấm men Saccharomyces, Hanseniaspora và Candida từ 21 dòng nấm men đã được phân lập.. - Từ khóa: Tuyển chọn, định danh, sinh trưởng, môi trường dinh dưỡng, giống nấm men. - Trong quá trình lên men rượu vang có thể sử dụng biện pháp lên men từ nguồn nấm men có sẵn trong môi trường (tự nhiên) và lên men từ nguồn nấm men thuần (được phân lập và tuyển chọn). - Hầu hết các loài nấm men dại được tìm thấy trong các loại rượu lên men tự nhiên bao gồm Candida, Hanseniaspora, Pichia và Zygosaccharomyces. - Việc sử dụng nấm men sẵn có trong môi trường để tạo đặc tính lên men tự nhiên của nguyên liệu. - theo vùng có thể kiểm soát được quá trình lên men với nấm men nuôi cấy và dự đoán được chất lượng của sản phẩm sản xuất ra. - Các loại rượu vang có thể lên men từ ngay chính các dòng nấm men thu nhận được từ nguồn nguyên liệu. - Thành phần của môi trường nuôi cấy và lên men có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của nấm men và trao đổi chất của tế bào, đặc biệt là có thể quyết định cả hiệu suất lên men.. - Vì vậy trên cơ sở đã phân lập được 21 giống nấm men thuần từ nước thốt nốt thu hoạch tại Tịnh Biên, An Giang (từ thí nghiệm trước đã được thực hiện), mục tiêu của nghiên cứu này là tuyển chọn môi trường dinh dưỡng tốt nhất cho quá trình tăng trưởng của các dòng nấm men đã được phân lập và thực hiện định danh ở mức độ giống các dòng nấm men nhằm tạo cơ sở chọn lọc nguồn nấm men có hoạt tính sinh học cao và khả năng lên men tốt nhất cho quá trình sản xuất rượu vang thốt nốt.. - 2.1.1 Nguồn giống nấm men:. - 21 dòng nấm men được phân lập từ thí nghiệm trước (trong cùng dự án nghiên cứu này) thể hiện ở bảng 1.. - Bảng 1: Các dòng nấm men sử dụng trong thí nghiệm. - TT Dòng nấm men phân lập Thời gian thu mẫu nước thốt nốt. - 2.1.4 Hóa chất và môi trường sử dụng. - 2.2.1 Tuyển chọn môi trường dinh dưỡng. - Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng phát triển của các (21) dòng nấm men đã được phân lập. - Nhân tố A: Môi trường dinh dưỡng: Sabouraud, MEA (Malt Extract Agar), PYGA (Potato Yeast Glucose Agar).. - Nuôi cấy nấm men thuần chủng trên ba môi trường tổng hợp Sabouraud, PYGA và MEA, theo dõi khả năng phát triển của khuẩn lạc và nấm men để chọn môi trường thích hợp nhất cho nấm men phát triển và bảo quản nấm men giống đã phân lập.. - Giống nấm men thuần được bảo quản để giữ các đặc tính ban đầu, giống được giữ trên các ống nghiệm thạch nghiêng và được bảo quản ở nhiệt độ 4 o C.. - 2.2.2 Định danh nấm men. - Dựa vào khóa phân loại nấm men để định danh ở mức độ giống các dòng nấm men đã được phân lập bằng các phương pháp: dựa vào mô tả đặc điểm hình thái của tế bào nấm men trên môi trường Malt-Agar. - quan sát hình dạng nấm men trên kính hiển vi. - quan sát tế bào nẩy chồi nuôi cấy trên môi trường dịch thể cao nấm men–. - quan sát bào tử khi nuôi cấy trên môi trường thạch agar bằng cách nhuộm màu với Malachite green và Safranine. - dựa vào đặc điểm sinh lý thử khả năng lên men các loại đường khác nhau: glucose, saccharose, bằng ống Durham (Kurtzman và Fell, 1999) của các giống nấm men đã phân lập. - và khả năng hoạt hóa urease khi nuôi cấy trên môi trường Christensen và định danh các giống nấm men.. - Quan sát hình dạng, kích thước khuẩn lạc và tế bào nấm men nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng bằng mắt thường và kính hiển vi, số khuẩn lạc/đĩa (đếm sống), số tế bào nấm men/ml mẫu (đếm trực tiếp) và định danh tên giống nấm men. - 3.1 Sự phát triển của nấm men trên ba môi trường dinh dưỡng: Sabouraud, PYGA và MEA. - Kết quả cho thấy khi nuôi cấy 21 dòng nấm men trên ba môi trường dinh dưỡng thì khuẩn lạc đều có dạng tròn, màu sắc khuẩn lạc có sự thay đổi khi nuôi cấy trên hai môi trường Sabouraud và MEA, kích thước khuẩn lạc của từng dòng nấm men cũng có sự thay đổi. - Trong khi đó kích thước tế bào nấm men có sự thay đổi không đáng kể. - Kết quả này phù hợp với Lương Đức Phẩm (2003), ông cho rằng hình thái và kích thước nấm men phụ thuộc vào mức độ phát triển, môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ và một số yếu tố khác. - Thực tế khảo sát cho thấy môi trường PYGA có chứa nhiều chất dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của nấm men. - Do vậy có thể sử dụng môi trường PYGA cho thời gian đầu của quá trình phân lập nấm men có thể tiết kiệm chi phí.. - Bên cạnh đó, môi trường MEA là môi trường để nuôi cấy nấm men và nấm mốc, tuy nhiên các dòng nấm men trong nước thốt nốt không phát triển tốt nhất khi nuôi cấy trên môi trường MEA. - Ngoài ra, môi trường Sabouraud là môi trường tổng hợp chuyên biệt cho phân lập nấm men, với thành phần peptone cung cấp nitơ, carbon, acid amin, vitamin và khoáng cần thiết cho nấm men phát triển, thành phần glucose là carbohydrate lên men góp phần tăng cường sự phát triển nấm men.. - Kết quả nghiên cứu cho thấy số lượng tế bào nấm men /ml của 21 dòng nấm men phân lập (sử dụng 1ml dung dịch nấm men ban đầu nuôi cấy trên ba môi trường PYGA, Sabouraud và MEA) đã thể hiện sự phát triển vượt trội và khác biệt có ý nghĩa khi nuôi cấy trên môi trường Sabouraud so với môi trường PYGA và MEA (Bảng 2). - Điều này cho thấy rõ môi trường Sabouraud là thích hợp nhất cho tất cả các dòng nấm men phân lập được. - (2003), các tác giả cũng cho rằng môi trường Sabouraud là môi trường thích hợp cho nấm men phát triển. - Vì vậy, trong thí nghiệm này, môi trường Sabouraud được chọn để phân lập nuôi cấy các dòng nấm men.. - Bảng 2: Số lượng tế bào nấm men (Log 10 tế bào/ml) của 21 dòng nấm men nuôi cấy trong ba môi trường dinh dưỡng PYGA, Sabouraud và MEA. - Dòng nấm men PYGA MEA Saubouraud. - 3.2 Định danh các giống nấm men phân lập. - (1972) có thể định danh sơ bộ các giống nấm men dựa vào đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý. - Đặc điểm hình thái bao gồm mô tả hình thái tế bào nấm men khi nuôi cấy trên môi trường malt agar sau thời gian nuôi cấy 3 ngày, sự hình thành tế bào nẩy chồi khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể malt–yeast–glucose–pepton sau thời gian 1–2 ngày ủ và sự hình thành bào tử khi nuôi cấy trên môi trường thạch nước sau thời gian 2–3 ngày ủ. - Đặc điểm sinh lý bao gồm: khả năng lên men đường và khả năng phân giải ure của nấm men.. - Đặc điểm hình thái của 21 dòng nấm men phân lập:. - Hình thái tế bào nấm men của 21 dòng nấm men khi phát triển trên môi trường malt-agar được thể hiện ở hình 1.. - Kết quả mô tả đặc điểm hình thái tế bào nấm men cho thấy tất cả 21 dòng nấm men này có thể được xếp thành 5 nhóm hình dạng đặc trưng như sau:. - nấm men có hình elip kéo dài, gồm 3 dòng nấm men CK1, CS1, CM1.. - tế bào nấm men hình ovan, gồm 3 dòng nấm men CK2, CS2 và CM2.. - nấm men hình tròn, gồm 6 dòng nấm men SK2, SS2, SM2, CK3, CS3, CM3.. - tế bào nấm men có hình elip, nhọn ở hai đầu, gồm 6 dòng nấm men SK1, SS1, SM1, CK4, CS4 và CM4.. - nấm men hình ovan có kích thước nhỏ, bao gồm 3 dòng nấm men CK5, CS5, CM5.. - Hình 1: Đặc điểm hình thái tế bào nấm men của 21 dòng nuôi cấy trên môi trường malt agar. - Đặc điểm nẩy chồi của 21 dòng nấm men phân lập khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể malt–yeast–glucose-pepton thể hiện ở hình 2.. - CK4, CS4, CM4 (5) CK5, CS5, CM5 Hình 2: Sự hình thành tế bào nẩy chồi của 21 dòng nấm men nẩy chồi nhiều. - Tế bào nẩy chồi nhiều hướng bao gồm 4 nhóm hình dạng: nhóm 1 nấm men hình elip dài (CK1, CS1, CM1), nhóm 2 nấm men hình ovan (CK2, CS2, CM2), nhóm 3 có dạng nấm men hình tròn (SK2, SS2, SM2, CK3, CS3, CM3) và nhóm 5 nấm men dạng hình ovan nhỏ (CK5, CS5, CM5).. - Tế bào nẩy chồi lưỡng cực: nhóm 4 nấm men có dạng hình elip nhọn (SK1, SS1, SM1, CK4, CS4 và CM4). - Sự hình thành bào tử của các dòng nấm men trên môi trường thạch được thể hiện ở bảng 3.. - Bảng 3: Sự hình thành bào tử của 21 dòng nấm men phân lập. - Nhóm hình dạng nấm men Các dòng nấm men Đặc điểm phát triển 1 (hình elip dài) CK1, CS1, CM1 Nhiều tế bào xuất hiện 1 -3. - Riêng 3 dòng nấm men hình ovan (nhỏ) thuộc nhóm 5 (CK5, CS5, CM5) không hình thành bào tử túi.. - Đặc điểm sinh lý của 21 dòng nấm men phân lập. - Khả năng lên men đường: khả năng lên men đường của 21 dòng nấm men trên các loại đường glucose và saccharose trong ống nghiệm có chuông Durham (theo phương pháp của Kurtzman và Fell, 1998) được thể hiện ở bảng 4.. - Bảng 4: Khả năng lên men đường glucose và saccharose của 21 dòng nấm men phân lập Nhóm hình. - dạng nấm men. - Các dòng nấm men. - Kết quả cho thấy 21 dòng nấm men phân đều lên men được đường glucose. - Trong đó, ba dòng nấm men nhóm 2 (CK2, CS2, CM2) và sáu dòng nấm men nhóm 3 (SK2, SS2, SM2, CK3, CS3, CM3) lên men đường saccharose. - Riêng ba dòng nấm men nhóm 5 (CK5, CS5, CM5) lên men đường saccharose rất yếu. - Ngoài ra, 3 dòng nấm men thuộc nhóm 1 và 6 dòng nấm men thuộc nhóm 4 không lên men đường saccharose. - Đây là cơ sở để xây dựng phương pháp nhận diện các loài nấm men. - Các quan sát và lý thuyết cũng cho thấy giống nấm men Saccharomyces lên men rượu vang đều lên men được đường glucose và tỷ số các đường mà nấm men sử dụng là đặc điểm riêng của từng loài (Lương Đức Phẩm, 2006). - Hoạt tính phân giải ure: sự thay đổi màu sắc môi trường Christensen của khi nuôi cấy 21 dòng nấm men phân lập sau thời gian ủ 7 ngày. - Kết quả cho thấy khi nuôi cấy nhóm 1 (CK1, CS1, CM1), nhóm 2 (CK2, CS2, CM2), nhóm 3 (SK2, SS2, SM2, CK3, CS3, CM3), và nhóm 4 (SK1, SS1, SM1, CK4, CS4 và CM4) sau 7 ngày, không có sự chuyển màu trên môi trường Christensen. - Trong khi đó 3 dòng nấm men nhóm 5 (CK5, CS5, CM5) trên môi trường Christensen đã chuyển sang màu đỏ sẫm. - Nguyễn Lân Dũng và ctv (1972) cho rằng khi nuôi cấy nấm men trong môi trường Christensen, một số nấm men có khả năng sinh enzyme urease để phân giải ure và môi trường chuyển màu đỏ sẫm. - Do vậy có thể kết luận ba dòng nấm men nhóm 5 (CK5, CS5, CM5) có khả năng phân giải ure. - Riêng 18 dòng nấm men thuộc nhóm khi nuôi cấy trên môi trường Christensen sau 7 ngày thì môi trường không chuyển sang màu đỏ sẫm, vì vậy có thể kết luận các. - dòng nấm men này không có khả năng phân giải ure. - Tổng hợp đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý của 21 dòng nấm men phân lập thể hiện ở bảng 5.. - Tổng hợp đặc điểm hình thái và sinh lý của 21 dòng nấm men phân lập Nhóm. - hình dạng nấm men. - Dòng nấm men. - Trên cơ sở các kết quả tổng hợp đặc điểm phân loại nấm men của 21 dòng nấm men, đặc điểm hình thái nấm men, đặc điểm nẩy chồi, sự hình thành bào tử và đặc điểm sinh lý, có thể định danh sơ bộ 21 dòng nấm men phân lập như sau:. - Các dòng nấm men thuộc nhóm 1 (CK1, CS1, CM1), nhóm 2 (CK2, CS2, CM2) và nhóm 3 (SK2, SS2, SM2, CK3, CS3, CM3) có những đặc điểm giống nhau như hình dạng tế bào nấm men hình tròn, ovan, elip, tế bào sinh dưỡng nẩy chồi nhiều hướng, sinh sản hữu tính bằng cách hình thành bào tử túi, mỗi túi chứa 1–4 bào tử hình tròn, sử dụng đường lên men, không phân giải ure. - Những đặc điểm này tương tự với mô tả đặc điểm hình thái, phân loại sơ bộ của giống nấm men Saccharomyces của Nguyễn Đức Lượng và ctv (2003), Kurtzman và Fell (1998) mô tả giống nấm men Saccharomyces có tế bào sinh dưỡng nẩy chồi nhiều hướng, hình tròn, hình trứng, hình ovan hoặc elip kéo dài, tạo thành 1–4 bào tử hình tròn, hình trứng, bề mặt trơn láng, sử dụng đường lên men và không có hoạt tính phân giải ure. - Như vậy có thể kết luận 15 dòng nấm men SK2, SS2, SM2, CK3, CS3, CM3, CK2, CS2, CM2, CK1, CS1, CM1, CK5, CS5, CM5 là giống Saccharomyces.. - Ngoài ra, 6 dòng nấm men thuộc nhóm 4 (SK1, SS1, SM1, CK4, CS4, CM4) giống nhau các đặc điểm hình dạng tế bào nấm men hình elip và nhọn ở hai đầu (hình quả chanh Châu Âu), tế bào sinh dưỡng nẩy chồi lưỡng cực, hình thành 1–4 bào tử hình cầu, bán cầu, lên men đường và không có khả năng sinh enzyme urease. - Những đặc điểm mô tả này phù hợp với tài liệu của Nguyễn Đức Lượng và ctv (2003) và Kurtzman và Fell (1998), mô tả hình thái của giống nấm men. - Trên cơ sở đó có thể kết luận sáu dòng nấm men phân lập SK1, SS1, SM1, CK4, CS4, CM4 thuộc giống nấm men Hanseniaspora.. - Ngoài ra, ba dòng nấm men thuộc nhóm 5 (CK5, CS5, CM5) có những đặc điểm giống nhau như tế bào sinh dưỡng nẩy chồi nhiều hướng, không hình thành bào tử túi, lên men đường và có khả năng hoạt hóa urease. - Những đặc điểm này giống với mô tả hình thái giống nấm men Candida của Nguyễn Đức Lượng và ctv (2003), giống này không sinh bào tử, tế bào sinh dưỡng nẩy chồi nhiều phía, sử dụng đường lên men và một vài loài có khả năng phân giải ure (Lương Đức Phẩm, 2006). - Môi trường Sabouraud là môi trường tốt nhất cho tất cả các dòng nấm men phát triển và cũng là môi trường thích hợp để phân lập, tuyển chọn và nuôi cấy giống nấm men. - Ngoài ra với 21 dòng nấm men được phân lập từ nước thốt nốt ban đầu, kết quả của khảo sát tiếp theo đã bước đầu định danh được 21 dòng nấm men này thuộc ba giống nấm men Saccharomyces và Hanseniaspora và Candida.. - Nấm men công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội.