- TUYỂN CHỌN NẤM MEN CHỊU NHIỆT VÀ ỨNG DỤNG LÊN. - Cayratia trifolia, khả năng chịu ethanol, nấm men chịu nhiệt, rượu vang trái giác, Sacccharomyces sp. - Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu phân lập và tuyển chọn chủng nấm men chịu nhiệt có khả năng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia L. - Kết quả phân lập được 50 chủng nấm men từ 16 nguồn trái giác thu thập ở 4 tỉnh Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long và Tiền Giang thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long. - Dựa vào các khóa phân loại của nấm men như hình thái, sinh lý và sinh hóa, các chủng nấm men phân lập được phân loại gồm 3 giống Sacccharomyces, Pichia và Hanseniaspora.. - Kết quả thử nghiệm khả năng chịu nhiệt và chịu ethanol đã sơ tuyển được 23 chủng nấm men có khả năng chịu nhiệt và chịu ethanol lần lượt trong khoảng 37-43 o C và 9-12% (v/v). - Từ kết quả lên men dịch trái giác ở 37°C đã tuyển chọn được chủng Saccharomyces sp. - HG1.3 có khả năng lên men tốt nhất với hàm lượng ethanol đạt đến 9,9% (v/v).. - Tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và ứng dụng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia L.) từ tỉnh Hậu Giang. - là những hợp chất có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa (Kumar et al., 2011). - Đây là nguồn nguyên liệu phong phú cho việc nghiên cứu và chế biến các loại rượu vang trái cây, vừa đa dạng hóa sản phẩm từ trái giác và tạo ra một sản phẩm lên men có lợi cho sức khỏe. - Với hàm lượng chất khô của trái giác khoảng 4,0-6,5°Brix, đây cũng là nguồn nguyên liệu có thể được sử dụng để đa dạng hóa các nguồn phân lập nấm men bản địa.. - Bản chất của rượu vang trái cây là sản phẩm được sản xuất từ nước dịch trái cây bằng phương pháp lên men với sự tham gia của các chủng nấm men để chuyển hóa đường thành ethanol trong điều kiện kỵ khí (Bùi Ái, 2005). - Tuy nhiên, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của nấm men, đặc biệt là nhiệt độ lên men và hàm hượng ethanol trong dịch lên men. - Nhiệt độ là một trong những yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men ethanol của nấm men (Banat et al., 1992;. - Do đó, việc sản xuất rượu vang bằng nấm men gặp nhiều khó khăn và thử thách. - Chi phí dùng làm lạnh rất tốn kém nên việc chọn lọc các chủng nấm men chịu nhiệt có thể giúp giảm được chi phí này (Limtong et al., 2007. - Ngoài ra, quá trình lên men ở nhiệt độ cao còn được ghi nhận với một số ưu điểm như: giảm lượng oxy hòa tan trong dịch lên men nên tạo điều kiện kỵ khí tốt hơn, hoạt động của enzyme tốt hơn và giảm thiểu sự phát triển của vi khuẩn tạp nhiễm (Roehr, 2001). - Những chủng nấm men có khả năng phát triển và lên men ethanol. - Mục tiêu của nghiên cứu nhằm phân lập và tuyển chọn nấm men từ trái giác có khả năng chịu nhiệt, chịu ethanol và lên men ethanol để ứng dụng trong lên men rượu vang trái giác.. - 2.2 Phân lập nấm men. - 2.3 Xác định đặc điểm hình thái và sinh hóa của các chủng nấm men. - Các chủng nấm men phân lập được phân loại sơ bộ đến mức độ giống dựa vào các đặc điểm như:. - hình dạng và kích thước tế bào nấm men, khả năng lên men đường saccharose, maltose và glucose, hoạt tính phân giải urea và gelatin (Kreger-van Rij, 1984. - 2.4 Thử nghiệm khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men. - Cấy các chủng nấm men phân lập được lên đĩa petri có chứa môi trường YPD agar. - Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc với đặc điểm đặc trưng (tương tự như khi phát triển ở 30 o C) của các dòng nấm men trên môi trường thạch (Phong et al., 2016. - Tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng phát triển ở nhiệt độ 37 o C.. - 2.5 Thử nghiệm khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men. - Cấy các chủng nấm men phân lập được lên đĩa petri có chứa môi trường YPD agar có bổ sung ethanol tinh khiết và 15% (v/v) [ethanol 96%, Merck]. - Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc với đặc điểm đặc trưng (tương tự như khi phát triển ở 30 o C) của các dòng nấm men trên môi trường thạch.. - 2.6 Khảo sát khả năng lên men ethanol của chủng nấm men tuyển chọn. - Trái giác được thu thập ở tỉnh Hậu Giang và được ép lấy dịch quả, 9 mL dịch trái giác tự nhiên (pH 3,6 và 6,0 o Brix) được lên men trong ống nghiệm 10 mL có ống Durham úp ngược. - Để xác định khả năng lên men, dựa vào chiều cao cột khí sinh ra trong ống Durham ở 37ºC, ghi nhận chiều cao cột khí CO 2 (mm) trong ống Durham sau và 30 giờ lên men (Dung et al., 2012).. - Tuyển chọn các chủng nấm men có hoạt tính lên men tốt để thử nghiệm khả năng ứng dụng trong lên men rượu vang trái giác.. - 2.7 Thử nghiệm khả năng lên men rượu vang trái giác. - Nuôi cấy nấm men đã được sơ tuyển dựa trên khả năng lên men dịch trái giác trong môi trường YPD lỏng đến khi mật số tế bào nấm men đạt 10 8 tế bào/mL (xác định bằng phương pháp đếm trực. - Chủng 1 mL nấm men đã nuôi cấy vào các bình tam giác chứa 99 mL dịch trái giác thu thập từ tỉnh Hậu Giang, được điều chỉnh bằng đường saccharose về 22ºBrix (pH 3,6). - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập nấm men. - Từ 14 mẫu trái giác thu ở các tỉnh Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long và Tiền Giang đã phân lập được 50 chủng nấm men. - Dựa vào đặc điểm của 50 chủng nấm men phân lập có thể xếp thành 6 nhóm có hình dạng đặc trưng như ở Bảng 1.. - Bảng 1: Đặc điểm của các chủng nấm men phân lập được từ dịch quả trái giác. - Nhóm tế bào Chủng nấm men Tế bào nấm men (độ phóng đại E400) Đặc điểm tế bào Nhóm 1: tế bào. - VL4.1, TG3.2. - 3.2 Đặc điểm sinh hóa của các chủng nấm men. - Tất cả 50 chủng nấm men phân lập được đều có khả năng lên men đường glucose, trong đó chỉ có 10 chủng không có khả năng lên men saccharose và 11 chủng không có khả năng lên men maltose.. - Một số chủng không có khả năng lên men đường maltose hoặc saccharose do maltose và saccharose là disaccharide, nên trước khi hấp thụ, nấm men phải sử dụng enzyme đặc hiệu để thủy phân đường này thành đường đơn (maltose được phân hủy. - thành glucose bởi enzyme maltase và saccharose phân hủy thành glucose và fructose nhờ enzyme invertase), sau đó mới được vận chuyển vào tế bào, tuy nhiên có thể có một số chủng nấm men không thể tổng hợp các enzyme này trong quá trình lên men. - Theo Lương Đức Phẩm (2006), tùy vào đặc tính của từng loại nấm men mà chúng có thể sử dụng các loại đường khác nhau cho quá trình sinh trưởng và lên men, hầu hết nấm men đều sử dụng glucose là nguồn carbon cơ bản, tuy nhiên một số chủng nấm men lại có thể sử dụng trực tiếp đường disaccharide làm nguồn carbon.. - Tổng cộng có 9 chủng nấm men có hoạt tính urease, các chủng này chủ yếu thuộc nhóm tế bào hình elip (VL4.2, HG3.1, VL2.2, CT4.1, HG4.1, TG4.1, VL1.1, VL3.2 và TG3.2) và 20 chủng có hoạt tính gelatinase trong tổng số 50 chủng phân lập (Hình 1). - Bảng 2: Bảng tổng hợp đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng nấm men Chủng. - nấm men. - Khả năng lên men đường Phân giải urea. - CT1.1, TG2.2. - Chủng nấm men. - VL1.1,. - HG2.1,. - VL3.1,. - 3.3 Khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men. - Sau 48 giờ cấy nấm men trên môi trường YPD agar, tất cả các chủng nấm men đều phát triển ở khoảng nhiệt độ 30-35 o C (Hình 2). - Ở nhiệt độ 37 o C, có 47 chủng phát triển và ở mức 43 o C chỉ quan sát được sự phát triển của 3 chủng nấm men HG4.5, VL1.1 và TG2.3. - Không có chủng nấm men nào phát triển ở 45-47 o C sau 48 giờ ủ. - này chứng tỏ nhiệt độ là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của các dòng nấm men. - Kết quả này cũng tương đồng với một số nghiên cứu đã công bố, khi nhiệt độ tăng cao làm ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng và lên men của nấm men (Nuanpeng et al., 2016. - Để tuyển chọn nấm men chịu nhiệt, 47 chủng nấm men phát triển ở mức 37-43 o C được sử dụng để tiếp tục thử nghiệm khả năng chịu ethanol.. - Hình 2: Khuẩn lạc nấm men phát triển ở các nhiệt độ khác nhau 3.4 Khả năng chịu ethanol của các chủng. - Sau 48 giờ cấy nấm men trong môi trường dinh dưỡng YPD agar, tất cả 47 chủng nấm men đều phát triển trong môi trường có bổ sung đến 6%. - Ở mức 9% ethanol, có 23 chủng phát triển được và chỉ 10 chủng nấm men phát triển ở mức 12% (v/v) ethanol (Hình 3). - Tuy nhiên, không có chủng nấm men nào phát triển ở 15% (v/v) ethanol sau 48 giờ ủ. - Nhìn chung, các chủng nấm men này có khả năng chịu ethanol tương đối cao, đến 9% (v/v) ethanol ở 37°C. - cũng được ghi nhận từ một số công bố về khả năng chịu ethanol của nấm men chịu nhiệt (Dung et al., 2012. - Khả năng chịu ethanol của nấm men được xem là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng của các chủng nấm men trong thực tế sản xuất. - Từ kết quả thử nghiệm này đã tuyển chọn được 23 chủng nấm men có khả năng phát triển trên môi trường YPD bổ sung 9-12% (v/v) ethanol. - Các chủng này được sử dụng để đánh giá khả năng lên men ethanol từ dịch trái giác.. - Hình 3: Khuẩn lạc nấm men trên môi trường YPD ở các nồng độ ethanol. - 3.5 Khả năng lên men ethanol của các chủng nấm men. - Chiều cao cột khí trong ống Durham ở Bảng 3 cho thấy cường độ lên men của các chủng nấm men ở từng thời điểm lên men là khác nhau. - Kết quả cho thấy 22 chủng nấm men có khả năng lên men dịch trái giác và chỉ có duy nhất một chủng (HG4.2) không có khả năng lên men dịch trái giác.. - Chiều cao của cột khí tăng liên tục, đến thời điểm 24 giờ thì hầu hết các chủng nấm men có cột khí chiếm đầy ống (30 mm).. - Lên men dịch trái giác (mm cột khí). - 3.6 Khả năng lên men rượu vang trái giác sử dụng nấm men chịu nhiệt. - Khả năng lên men được khảo sát với mật số nấm men ban đầu trong dịch lên men là 10 6 tế bào/mL, thời gian ủ là 7 ngày ở 37°C. - Trong quá trình lên men, nấm men sử dụng đường làm nguồn carbon nên làm Brix giảm và sự hình thành các acid hữu. - cơ làm pH dịch lên men giảm (Lê Ngọc Tú et al., 2005). - Độ rượu là một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá khả năng lên men rượu của các chủng nấm men. - Kết quả thống kê ở Bảng 5 cho thấy trong 22 chủng nấm men lên men rượu vang trái giác, hàm lượng ethanol trung bình sau lên men trong khoảng 4,1-9,9% (v/v), trong đó hàm lượng ethanol đạt cao nhất với chủng Saccharomyces sp. - Bảng 4: Kết quả khảo sát khả năng lên men của các chủng nấm men. - STT Chủng nấm. - lên men pH sau lên men. - Có thể lý giải do thời gian thí nghiệm trong ống Durham ngắn, các chủng nấm men ban đầu lên men nhanh tạo ra lượng CO 2 nhiều, tuy nhiên chiều cao ống Durham tối đa chỉ có 30 mm nên không thể đánh giá chính xác được khả năng lên men của các chủng nấm men khi trung bình chiều cao cột khí. - Do đó, khi tiến hành lên men trong bình tam giác, các chủng nấm men có thời gian lên men dài hơn, giúp cho việc đánh giá chủng nấm men có hoạt tính lên men tốt một cách chính xác hơn. - HG1.3 có hàm lượng ethanol sinh ra cao nhất (9,9% v/v) được chọn là chủng nấm men có tiềm năng lên men tốt so với các chủng còn lại.. - Từ 16 nguồn trái giác thu ở các tỉnh Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long và Tiền Giang đã phân lập được 50 chủng nấm men thuần chủng. - Dựa trên mô tả các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý bước đầu đã xác định được 3 giống nấm men là Saccharomyces, Hanseniaspora và Pichia. - Kết quả thử nghiệm khả năng chịu nhiệt và chịu ethanol đã sơ tuyển được 23 chủng nấm men chịu nhiệt trong khoảng 37-43 o C và chịu ethanol ở mức 9-12%. - Từ kết quả lên men rượu vang trái giác từ tỉnh Hậu Giang ở 37 o C đã tuyển chọn được chủng Saccharomyces sp. - HG1.3 có khả năng lên men tốt nhất với nồng độ ethanol đạt 9,9% (v/v).. - Công nghệ lên men ứng dụng trong Công nghệ thực phẩm. - Nấm men công nghiệp.. - Thử nghiệm lên men ethanol ở nhiệt độ cao bằng nấm men chịu nhiệt