- Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong chọn giống lúa chịu ngập chìm. - Nhằm mục đích tìm kiếm chỉ thị có thể sử dụng để phát hiện gen chịu ngập trong các cá thể con lai tiến hành phản ứng PCR với ADN của các giống lúa 1.Q5c. - Các chỉ thị SSR cho đa hình giữa giống cho và nhận gen chịu ngập. - Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM17. - Hai chỉ thị này liên kết rất chặt với gen Sub1. - Sau đó, để lựa chọn các cá thể tái tổ hợp tiến hành sử dụng 10 chỉ thị cho đa hình trên nhiễm sắc thể số 9, những chỉ thị này nằm về hai phía của gen Sub1 có khoảng cách gần nhất là 1,8 Mb ở đầu trên tại vị trí của R9M10 và 2,8Mb ở đầu dưới tại vị trí của RM24013 so với gen Sub1 (vị trí của gen Sub1 là 6.3–6.6 Mb hoặc 4.4–6.8 cM). - 1 Lựa chọn cá thể ART5, SC3. - Kết quả khảo sát đa hình với ADN các giống cho và nhận gen với chỉ thị RM18. - 2 Lựa chọn cá thể tái tổ hợp. - Thế hệ F 1 lai tạo được 22 cá thể. - Các cá thể này được trồng, tách chiết ADN để xác định cây lai nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử.. - Để xác định các cá thể F 1 mang gen kháng, tiến hành phản ứng PCR với AND của mẹ (AS996) và bố (IR64Sub1) và các con lai F 1 với hai chỉ thị cho đa hình liên kết chặt với gen Sub1 là SC3, ART5. - Kết quả kiểm tra xác định cá thể mang gen được minh họa ở hình 10.. - Kiểm tra cá thể mang gen kháng ở thế hệ F 1 với chỉ thị SC3 Giếng số 1: AS996, giếng số 2: IR64Sub1, giếng 3-24 con lai F 1. - Trong tổng số 22 cá thể F 1 được đánh số từ 1-22 tương ứng từ giếng số 3 đến giếng số 24, ghi nhận có 11 mẫu ADN của 11 cá thể có mang 2 băng: 1 băng đặc trưng cho AS996, một băng đặc trưng cho IR64Sub1 là các cá thể số . - Các cá thể này được chọn làm mẹ để tiến hành lai trở lại với giống nhận gen tạo thế hệ BC 1 F 1. - Dựa trên bản đồ vùng QTL chịu ngập thì chỉ thị tốt nhất trong khu vực Sub1 là ART5 được thiết kế từ vùng promoter của gen và SC3 được thiết kế ở phía dưới của gen Sub1 trên NST số 9 được sử dụng để lựa chọn những cá thể mang gen. - Tổng số 497 cá thể của quần thể BC 1 F 1 đƣợc tiến hành tách chiết ADN và kiểm tra sự có mặt của gen đích (Sub1) bằng hai chỉ thị liên kết chặt là ART5 và SC3. - Kết quả trên hình 11 thể hiện khi phân tích các cá thể BC 1 F 1 với chỉ thị SC3 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống nhận gen ở giếng số 49 và giống cho. - Kết quả sàng lọc các cá thể BC 1 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị SC3. - Giếng 1, 26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: các cá thể BC 1 F 1. - Giếng số chỉ mang băng của giống nhận gen, những cá thể này không mang gen kháng được loại bỏ ở các bước sàng lọc sau.. - Kết quả trên hình 12 thể hiện khi phân tích các cá thể BC 1 F 1 với chỉ thị ART5 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống nhận gen ở giếng số 2 và giống cho gen ở giếng số 3 là các giếng số . - Kết quả thu được 165 cá thể BC 1 F 1 dị hợp tử với cả hai chỉ thị ART5 và SC3.. - Những cá thể dị hợp tử mang cả hai băng của giống nhận gen và giống cho gen với cả hai chỉ thị ART5 và SC3 được lựa chọn để chọn lọc các cá thể tái tổ hợp. - Sàng lọc cá thể tái tổ hợp từ 165 cá thể dị hợp tử mang gen đích Sub1 tiến hành sử dụng 10 chỉ thị cho đa hình trên nhiễm sắc thể số 9.. - Kết quả phân tích để sàng lọc cá thể tái tổ hợp trên NST 9.. - Sàng lọc các cá thể BC 1 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM23662 Giếng 1,26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: các cá thể BC 1 F 1 giếng 49:AS996,. - Kết quả sàng lọc các cá thể BC 1 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị ART5.Giếng 1, 50: 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3:IR64Sub1, 4-49: các cá thể BC 1 F 1. - Sàng lọc các cá thể BC 1 F 1 với chỉ thị RM23662 ở hình 13 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 44 và giếng số 46.. - Sàng lọc các cá thể BC 1 F 1 với chỉ thị RM240113 ở hình 14 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số và giếng số 46.. - Tương tự sàng lọc các cá thể BC 1 F 1 với chỉ thị RM7175 ở hình 15 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số và giếng số 46.. - Sử dụng 10 chỉ thị lựa chọn đƣợc tổng số 14 cá thể tái tổ hợp, trong đó 5/14 cá thể tái tổ hợp mang trao đổi chéo tại vị trí của R9M10 và RM24013. - 9/14 cá thể tái tổ hợp tại 1 đầu của NST tại vị trí của RM24013. - Kết quả 14 cá thể tái tổ hợp đƣợc lựa chọn để tìm cá thể mang nền di truyền cây mẹ lớn nhất là các cá thể số . - Số liệu của từng cá thể đƣợc đƣa vào phân tích trên chƣơng trình Graphical Genotyper để lựa chọn. - Các cá thể nào mang gen đồng hợp tử cây mẹ nhiều nhất sẽ. - Sàng lọc các cá thể BC 1 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM24013 Giếng bp ladder, 2-25 và 27-48: các cá thể BC 1 F 1 , giếng 49:AS996, giếng50:IR64Sub1. - Tỉ lệ phần trăm alen giống nhận gen của 14 cá thể BC 1 F 1 tái tổ hợp. - Từ kết quả trên cho thấy 14 cá thể tái tổ hợp có mang gen Sub1 và chứa tối đa nền gen của giống nhận gen từ 62,5% đến 87,5%. - Các cá thể có nền di truyền cao nhất là P422 với 87,5% ngoài ra còn có các cá thể P412 (84%) P428 (84. - Kết quả đã lựa chọn được 5 cá thể BC 1 F 1 có mang vùng gen Sub1 và chứa tối đa nền gen của giống nhận gen (R%) trong khoảng từ 80 - 86% để tiếp tục lai tạo thế hệ BC 2 F 1 . - Từ 5 cá thể BC 1 F 1 đƣợc lựa chọn đã lai tạo đƣợc quần thể thế hệ BC 2 F 1 với 506 cá thể. - Khi phân tích các cá thể BC 2 F 1 với chỉ thị SC3 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống cho gen và giống nhận gen là giếng số . - Sàng lọc các cá thể BC 2 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị SC3 1.AS996, 2. - IR64Sub1, các giếng ký hiệu từ C1-C41: các cá thể BC 2 F 1. - Những giếng còn lại các cá thể chỉ cho 1 băng của giống nhận gen là AS996 những cá thể này không mang gen Sub1.. - Khi phân tích các cá thể BC 2 F 1 với chỉ thị ART5 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống là giếng số . - Sau bƣớc sàng lọc gen đích với hai chỉ thị ART5 và SC3 để kiểm tra sự có mặt của gen đích Sub1 trong các cá thể con lai thu đƣợc 245 cá thể dị hợp tử mang hai băng của cả giống cho và nhận gen.. - Sau đó,Tiến hành chọn lọc các cá thể tái tổ hợp bằng 10 chỉ thị kề hai bên gen Sub1 trên nhiễm sắc thể số 9 được nêu ở bảng 8 với 245 cá thể mang gen. - Sàng lọc các cá thể BC 2 F 1 với chỉ thị RM316 ở hình 20 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số . - Sàng lọc các cá thể BC 2 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị ART5 ADN: 1AS996, 2. - IR64Sub1, Các giếng ký hiệu từ C67-C328: Các cá thể BC 2 F 1. - Sàng lọc các cá thể BC 2 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM316 1.AS996, 2. - IR64Sub1, C3-C189:Các cá thể BC 2 F 1. - Sàng lọc các cá thể BC 2 F 1 với chỉ thị RM105 ở hình 21 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số . - Sau khi sàng lọc với 10 chỉ thị trên NST số 9 chọn ra đƣợc 17 cá thể tái tổ hợp.. - Kết quả cá thể có nền gen cây nhận gen cao nhất là 93,75 % là cá thể số P442 -11 và P442 -14. - Cá thể có nền gen cây nhận gen thấp nhất là 89,7% ở cá thể số P39-80. - Ngoài ra, còn có các cá thể P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 có nền gen cây nhận gen là 92,25%. - Các cá thể có mang gen Sub1 và có nền gen cây nhận gen cao nhất là P442 -11 và P442 -14. - Tƣơng tự nhƣ với quần thể BC 2 F 1 cho thế hệ BC 3 F 1 với 445 cá thể. - Sử dụng hai chỉ thị ART5 và SC3 là hai chỉ thị liên kết chặt với gen Sub1 để lựa chọn cá thể mang gen Sub1 ở thế hệ BC 3 F 1 . - Sàng lọc các cá thể BC 2 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM105 ADN: 1.AS996, 2. - IR64Sub1, giếng 3-53: các cá thể BC 2 F 1. - Sàng lọc các cá thể BC 3 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị SC3 Giếng 1: 25bp ladder, 2-48: các cá thể BC 3 F 1 , giếng 49:AS996, giếng 50: IR64Sub1. - Khi phân tích các cá thể BC 3 F 1 với chỉ thị SC3 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống cho gen ở giếng số 49 và giống nhận gen ở giếng số 50 là giếng số . - Những giếng còn lại các cá thể đều mang băng của giống nhận gen AS996.. - Khi phân tích các cá thể BC 3 F 1 với chỉ thị ART5 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống nhận gen và giống cho gen là giếng số . - Các giếng còn lại các cá thể chỉ cho băng của AS996. - Lựa chọn những cá thể dị hợp tử với cả hai chỉ thị chúng tôi xác định được 124 cá thể mang gen Sub1. - Sau đó, 124 cá thể mang gen này tiếp tục sàng lọc với các chỉ thị trên NST số 9 để tìm ra các cá thể tái tổ hợp.. - Sàng lọc các cá thể BC 3 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị 7175 Giếng1:25bp ladder, 4-45:Các cá thể BC 3 F 1 , giếng 2,46 :AS996, giếng3,47: IR64Sub1. - Sàng lọc các cá thể BC 3 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị ART5 giếng 1, 27:. - 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3:IR64Sub các cá thể BC 1 F 1. - Sàng lọc các cá thể BC 3 F 1 với chỉ thị RM7175 ở hình 25 cho thấy tất cả các cá thể là tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử của giống nhận gen.. - Sàng lọc các cá thể BC 3 F 1 với chỉ thị RM24013 ở hình 26 cũng cho thấy tất cả các cá thể là tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử của giống nhận gen.. - Sàng lọc từ 10 chỉ thị cho đa hình trên NST số 9 với 124 cá thể. - Kết quả chọn được 22 cá thể tái tổ hợp. - Những cá thể này được tiếp tục chọn lọc nền di truyền của giống nhận gen. - Sử dụng 19 chỉ thị trên 11 nhiễm sắc thể còn lại. - Sàng lọc các cá thể BC 3 F 1 ở hình 3.26 với chỉ thị RM10115 trên NST số 1 và Chỉ thị S11117C trên NST số 11 nhận thấy tất cả các cá thể đều mang băng đồng hợp tử giống nhận gen là AS996. - Sàng lọc các cá thể BC 3 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM10115 (trái) Giếng1,25:. - 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3: IR64Sub1 4-24:các cá thể BC 3 F 1. - S1117C (phải) giếng1: 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3: IR64Sub1 4-24:các cá thể BC 3 F 1 . - Sàng lọc các cá thể BC 3 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM24013 Giếng 47: 25bp ladder,3-44: Các cá thể BC 3 F 1, giếng1, 45:AS996, giếng2, 46: IR64Sub1. - Sàng lọc các cá thể tái tổ hợp BC 3 F 1 ở hình 29 với chỉ thị R4M17 trên NST số 4 còn 3 cá thể ở giếng số 3, 4, 5, vẫn mang băng của giống cho gen. - Chỉ thị R5M20 trên NST số 5 thì các cá thể đều mang băng đồng hợp tử của giống nhận gen. - Sàng lọc các cá thể BC 3 F 1 ở hình 30 với chỉ thị RM341 trên NST số 2 và chỉ thị RM228 trên NST số 10 cũng nhận thấy tất cả các cá thể đều mang băng đồng hợp tử giống nhận gen là AS996. - Số liệu của từng cá thể đƣợc đƣa vào phân tích trên chƣơng trình Graphical Genotyper để lựa chọn cá thể BC 3 F 1 . - Các cá thể nào mang gen đồng hợp tử cây mẹ nhiều nhất sẽ đƣợc lựa chọn để lai cho lai tạo thế hệ BC 4 F 1.. - Biểu đồ 12NST của 22 cá thể thế hệ BC 3 F 1 (AS996/IR64 Sub1) Hình 29. - Sàng lọc các cá thể BC 3 F 1 (AS996/IR64Sub1) với chỉ thị R4M17 và R5M20 Giếng1,26 AS996, giếng 2,27: IR64Sub các cá thể BC 3 F 1 , giếng25: 25bp. - Kết quả xác định đƣợc hai cá thể P422-14-164 và P422-14-178 có nền gen cây nhận lên đến 96.29% so với AS996 ban đầu, cá thể số là tốt nhất với 100% alen từ AS996 trong tổng số 53 chỉ thị sử dụng. - Tất cả 3 cá thể này một mặt đƣợc dùng để tự thụ cho gen Sub1 đồng hợp tử BC 3 F 2 , đồng thời tiếp tục lai tạo quần thể BC 4 F 1.. - Xác định đƣợc 11 cá thể mang gen Sub1 từ 22 cá thể F 1 từ tổ hợp lai AS996 x IR64Sub1.. - 2/ Kết quả sàng lọc 497 cá thể BC 1 F 1 thu đƣợc 165 cá thể mang gen Sub1, từ đó chọn lọc đƣợc 14 cá thể tái tổ hợp mang gen Sub1 và chứa tối đa nền gen giống nhận gen từ . - Trong đó, cá thể có nền gen của giống nhận gen cao nhất là P422 với 87,50%.. - 3/ Kết quả sàng lọc 506 cá thể BC 2 F 1 thu đƣợc 245 cá thể mang gen Sub1, xác định đƣợc 17 cá thể tái tổ hợp mang gen Sub1 và hai trong số 17 cá thể này chứa nền gen của giống nhận gen cao nhất là cá thể P442 -11 và P442 -14 đạt 93,75. - 4/ Kết quả sàng lọc 445 cá thể BC 3 F 1 thu đƣợc 124 cá thể mang gen Sub1 trong đó có 22 cá thể tái tổ hợp