- Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong lá và nụ vối. - Xây dựng được phương pháp định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học. - Xây dựng được phương pháp định lượng CO-1 bằng HPLC. - Ứng dụng phương pháp xây được trong việc định lượng các mẫu lá và nụ vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc.. - a) Phương pháp ống nghiệm Phản ứng với hơi amoniac. - b) phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM). - a) Phương pháp cân: Ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavone hoặc flavonol và dịch chất ít tạp chất.. - Nguyên tắc: Phương pháp xác định dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch phức tạo thành giữa chất cần xác định với thuốc thử vô cơ hay hữu cơ trong môi trường thích hợp khi được chiếu bởi chùm sáng. - Phương pháp này cho phép xác định nồng độ chất ở khoảng M và là một trong những phương pháp được sử dụng khá phổ biến.. - Phương pháp trắc quang có độ nhạy, độ ổn định cũng như độ chính xác khá cao và là phương pháp được sử dụng phổ biến trong phân tích.. - Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. - Xây dựng phương pháp định tính flavonoid từ lá và nụ vối.. - Xây dựng phương pháp định lượng một flavonoid chính từ lá và nụ vối.. - Hóa chất: các hóa chất để làm các phản ứng định tính bằng phương pháp hóa học, định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lượng bằng phương pháp đo quang, HPLC.. - CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ vối. - Như vậy, có thể sử dụng mẫu chất CO-1 phân lập được làm chất đối chiếu trong phép xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid và chất này trong các mẫu nụ và lá vối.. - Bảng 3.1: Kết quả định tính flavonoid trong nụ và lá vối 3.2.2 Định tính bằng TLC. - Lọc, đem đi xác định hàm lượng.. - Sắc ký đồ chất đối chiếu (C). - Sắc ký đồ của nụ vối (N). - Để xác định độ lặp lại của phương pháp tiến hành với 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu nụ vối Hưng yên.. - Bảng 3.2: Kết quả độ lặp lại của phương pháp trắc quang. - Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy phương pháp có độ lặp lại có thể chấp nhận được thông qua RSD = 4,45% (<. - Xây dựng đường chuẩn bằng chất đối chiếu CO-1: Tiến hành pha một dãy dung dịch đối chiếu CO-1 (chất tách được từ nụ vối) với nồng độ chính xác là và 100 mg/l. - Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở (hình 3.6).. - Bảng 3.3: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu CO-1. - Nồng độ (mg/l . - Nồng độ CO-1 (mg/l). - Hình 3.6: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo CO-1. - Từ kết quả ở bảng 3.5 và hình 3.7 kết quả khảo sát trên cho thấy với nồng độ của chất đối chiếu CO-1 từ 12-100 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. - Kết quả được trình bày ở bảng 3.6. - Bảng 3.4: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất chuẩn catechin. - Nồng độ Catechin (mg/l). - Hình 3.7: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo catechin. - Kết quả ở bảng 3.6 và hình 3.8 kết quả khảo sát trên đã chỉ ra rằng với nồng độ của chất chuẩn catechin từ 45-450 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. - Bảng 3.5: Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng. - Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phương pháp khi dùng chất CO-1 làm chất đối chiếu:. - Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phương pháp khi dùng chất chuẩn catechin làm chuẩn:. - Bảng 3.6: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất đối chiếu CO-1. - Nồng độ CO-1 (mg/l . - Hình 3.8: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của CO-1. - Kết quả bảng 3.6 và hình 3.8 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 120 mg/l, tại nồng độ này trở đi thì đồ thị của độ hấp thụ quang theo nồng độ không còn tuyến tính. - Như vậy khoảng tuyến tính của phương pháp xác định theo chất đối chiếu CO-1 là khoảng từ mg/l.. - Bảng 3.7: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin. - Nồng độ catechin (mg/l . - Nồng độ catechin (mg/l). - Hình 3.9: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin. - Kết quả ở bảng 3.7 và hình 3.9 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 1000 mg/l, tại nồng độ này trở đi thì đồ thị của độ hấp thụ quang theo nồng độ không còn tuyến tính.. - Như vậy khoảng tuyến tính của phương pháp xác định theo chất chuẩn catechin là khoảng từ mg/l.. - Để xác định độ đúng thực hiện với một dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ chính xác 12 mg/l. - Sau đó tiến hành phân tích mẫu chuẩn đó lặp lại 6 lần, kết quả được ghi ở bảng 3.7. - Bảng 3.8: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp. - t tn : Không có sự khác nhau về kết quả của giá trị trung bình so với giá trị tham chiếu ở mức ý nghĩa α = 0,95, tức là phương pháp có độ đúng đạt yêu cầu → Phƣơng pháp không mắc sai số hệ thống.. - Kết quả được thể hiện ở bảng 3.9. - Bảng 3.9 : Kết quả đánh giá độ ổn định của phương pháp theo cách 1. - F tn = 1,55 : Như vậy hai phương sai không có sự khác nhau có ý nghĩa, hai phương pháp có độ lặp lại tương đồng.. - Kết quả định lƣợng flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối. - Giá trị kết quả của hàm lượng flavonoid toàn phần được làm lặp lại 3 lần và kết quả ở bảng 3.12 được biểu diễn : m ± SD. - Bảng 3.10 : Kết quả xác định flavonoid toàn phần. - Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn CO-1: Trong các mẫu lá vối trong khoảng mg/g. - Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn catechin: Trong các mẫu lá vối trong khoảng mg/g. - Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống được ghi ở bảng 3.11.. - Bảng 3.11. - Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống Lần. - Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.15 và đường chuẩn lập được, được thể hiện ở hình 3.12.. - Bảng 3.12: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính. - Dung dịch Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic (AU.s). - Hình 3.10: Đường chuẩn xác định hàm lượng CO-1 trong nụ và lá vối. - C C Độ lặp lại của phương pháp. - Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng cách tiến hành 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu chứa chất đối chiếu CO-1 có nồng độ 0,042 mg/ml (Bảng 3.13A) và mẫu thực nụ vối Hưng yên (Bảng 3.13B).. - Bảng 3.13A: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu CO-1. - Bảng3.13 B: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu thực. - Bảng 3.14: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp Tên mẫu. - Qua bảng trên cho thấy, phương pháp phân tích định lượng HPLC có khả năng thu hồi lại cao hơn 90% có thể chấp nhận được. - Như vậy phương pháp này có độ đúng cao.. - Tiến hành phân tích theo các điều kiện đã lựa chọn, ở nồn độ 0,031 μg/ml được coi là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp (Bảng 3.20) thể hiện qua việc tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N) đạt trong khoảng 2-3.. - Qua bảng 3.20 và hình 3.12 xác định được giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp xác định CO-1 là 0,031 μg/ml.. - Bảng 3.15: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL Nồng Độ. - Nồng độ CO-1 (mg/ml). - Hình 3.12: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL. - Từ kết quả (Bảng 3.15 và Hình 3.12) cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 0,275 mg/ml, tại nồng độ này trở đi trên đồ thị cho thấy diện tích píc và nồng độ không còn tuyến tính. - Như vậy, khoảng nồng độ tuyến tính CO-1 để định lượng cho kết quả tốt nhất được xác định nằm trong khoảng 0,1-275 μg/ml.. - 16: Kết quả định lượng hoạt chất trong một số mẫu nụ và lá vối. - Kết quả định lượng các mẫu thu hái tại một số địa phương ở miền bắc Việt Nam cho biết hàm lượng CO-1 trong lá vối nằm trong khoảng thấp hơn nhiều so với hàm lượng trong nụ vối trong khoảng . - Kết quả nghiên cứu này gợi ý cho việc xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu nụ và lá vối để kiểm nghiệm chất lượng dược liệu vối sử dụng cho y học cổ truyền.. - Đã phân lập được một flavonoid chính (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone) trong nụ vối làm chất đối chiếu trong xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid.. - Đã xây dựng được phương pháp định tính flavonoid trong nụ và lá vối bằng các phản ứng hóa học, sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).. - Xây dựng được phương pháp định lượng flavonoid:. - a) Bằng phương pháp trắc quang. - Xây dựng được phương pháp định lượng flavonoid toàn phần theo chất đối chiếu CO- 1 (được tách từ nụ vối) và theo catechin.. - Xác định được khoảng tuyến tính và đường chuẩn xác định lượng flavonoid là . - Độ đúng, độ ổn định của phương pháp phù hợp.. - Kết quả cho biết hàm lượng trong các mẫu nụ là mg/g, mẫu lá mg/g (tính theo chất đối chiếu CO-1). - Kết quả đã đánh giá được hàm lượng flavonoid trong nụ vối cao hơn trong lá vối có ý nghĩa thống kê.. - Xác định được giới hạn phát hiện (LOD = 0,031 μg/ml) và giới hạn định lượng của phép đo (LOQ = 0,1023 μg/ml). - Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y Học.. - Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Xuân Trung, Nguyễn Văn Ri (2003), Các phương pháp phân tích công cụ, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội.. - Trần Hùng (2007), Giáo trình, Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dược Tp HCM.. - Phạm Luận (2004), Cơ sở lý thuyết của phương pháp phân tích phổ hấp thụ quang phân tử UV-VIS, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên-ĐHQGHN. - Nguyễn Văn Ri, giáo trình môn học, Các phương pháp tách, Đại học Khoa học Tự Nhiên - ĐHQGHN. - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, NXB khoa học và kỹ thuật Hà nội.