Đánh giá sự biểu biểu hiện gen mã hóa Pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) ở các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sinh Amylase và Interleukin-2 bằng kỹ thuật Real-time PCR

- Đánh giá sự biểu biểu hiện gen mã hóa Pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) ở các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sinh Amylase và Interleukin-2 bằng kỹ thuật Real-time PCR.
- các protein ngoại lai và kỹ thuật Real-time PCR.
- mồi cho phản ứng PCR và Real-time PCR.
- kỹ thuật Real-time PCR.
- tối ưu điều kiện cho phản ứng Real- time PCR.
- kết quả Real-time PCR với gene nội chuẩn IPP1.
- real-time PCR về biểu hiện của gene MF(ALPHA)1.
- so sánh kết quả Real-time PCR và Microarray..
- pastoris đối chứng, chủng sinh tổng hợp interleukin-2, chủng sinh tổng hợp amylase cho thấy có 6 gen có sự khác biệt trong biểu hiện gen giữa các chủng nghiên cứu trong đó có gen mã hóa pheromone lai alpha (MF(ALPHA)..
- Kỹ thuật Real-time PCR đánh giá sự biểu hiện của gen sẽ có độ nhạy, độ chính xác lớn hơn và có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn hơn để đánh giá sự biểu hiện của gen (MF(ALPHA)1 từ đó có những định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao mức độ biểu hiện của gen ngoại lai trong chủng nấm men P.
- Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá sự biểu biểu hiện gen mã hóa Pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) ở các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sinh Amylase và Interleukin-2 bằng kỹ thuật Real-time PCR”.
- Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris 1.1.1.
- Đặc điểm hệ biểu hiện P.
- Tất cả các chủng biểu hiện của hệ biểu hiện P.
- Bảng 1.1: Các chủng biểu hiện P.
- Những ƣu điểm của hệ biểu hiện P.
- Chất cảm ứng biểu hiện protein là methanol, rẻ tiền.
- Vector biểu hiện gene ngoại lai của P.
- Đặc điểm chung của vector biểu hiện của P.
- Các vector biểu hiện trong P.
- gene sát nhập tại locus his4 do sự trao đổi chéo giữa locus his4 của nhiễm sắc thể nấm men và vector biểu hiện (Hình 1.5).
- Các dòng nấm men tái tổ hợp đa bản sao của vector biểu hiện chiếm 1-10% các chủng His + biến nạp..
- pastoris gốc ban đầu, nhưng trong vector biểu hiện pPIC9, do đó được đưa vào các chủng nấm men P.
- Kỹ thuật Real-time PCR 1.4.1.
- Tổng quan về Real-time PCR.
- Sự ra đời của kỹ thuật Real-time PCR là một bước đột phá trong công nghệ sinh học.
- Kỹ thuật này cho phép xác định kết quả của thí nghiệm sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR, chính vì vậy được gọi là “Real-time”.
- Kỹ thuật Real-time PCR được đặc trưng bởi giới hạn định lượng rất rộng, độ nhạy cảm cao đủ để phát hiện một phân tử duy nhất và khả năng lặp lại cao (độ lệch chuẩn nhỏ hơn 0,2 chu kỳ) Kỹ thuật Real-time PCR được đặc trưng bởi giới hạn định lượng rất rộng, độ nhạy cảm cao đủ để phát hiện một phân tử duy nhất và khả năng lặp lại cao..
- Phân tích kết quả Real-time PCR.
- Biểu đồ khuếch đại của Real-time PCR (amplification graph) 1.4.2.2.
- Phản ứng khuếch đại bằng Real-time PCR diễn ra theo cấp số nhân, do đó các mẫu có chu kỳ ngưỡng chênh nhau 1 đơn vị tương đương với sự khác biệt khoảng 2 lần về hàm lượng RNA của gene đích.
- Mồi cho phản ứng PCR và Real-time PCR Tên mồi Trình tự nucleotide.
- Máy móc và thiết bị:Máy Real-time PCR trên máy LightCycler của Roche version 2.0..
- Môi trường nuôi cấy chọn lọc và biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào nấm mem Pichia pastoris..
- 2.2.4 Kỹ thuật Real-time PCR.
- Phản ứng Real-time PCR trên máy LightCycler của Roche sử dụng chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green I.
- Trong một phản ứng Real-time PCR, chu trình mà ở đó tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt lên trên mức huỳnh quang nền được gọi là Ct (Crossing Point) của mẫu đó.
- Các chủng P.
- pastoris MSD1168 và biểu hiện thành protein ngoại lai, đây là cơ sở để có thể tiến hành các thí nghiệm tiếp theo..
- Khi tách RNA luôn có lẫn một lượng DNA nhất định ở trong mẫu nên phải loại bỏ lượng DNA này, vì để kết quả phân tích Real-time PCR đòi hỏi mẫu RNA tách chiết có độ tinh sạch cao và đặc biệt không bị lẫn DNA [30], nếu mẫu RNA còn lẫn DNA sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả thì nghiệm do DNA đó sẽ được nhân lên, nên việc loại bỏ DNA là yêu cầu bắt buộc..
- Thực hiện Real-time PCR với mẫu RNA để kiểm tra chất lượng của RNA có đảm bảo hay không..
- Khi mẫu RNA đã được xử lý bằng enzyme DNaseI thì các DNA lẫn sẽ bị phân giải hết, để khẳng định được điều này và đồng thời thử đánh giá sảm phẩm tách, chúng tôi tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu của gene il-2 để chứng minh mẫu có DNA hay không và chạy Real-time PCR để kiểm tra mRNA trong mẫu..
- Kết quả thí nghiệm này sẽ cho chúng ta đánh giá được chất lượng của mẫu RNA về cả phương diện mẫu có lẫn DNA hay không và mẫu có đủ tiêu chuẩn thực hiện phản ứng Real- time PCR hay không..
- Trên đường chạy điện di số 7 là chạy Real- time PCR với mẫu con đối chứng âm không mang gene ngoại lai nên không có băng nào..
- Với kết quả trên cho thấy RNA thu được đủ điều kiện để sử dụng cho Real-time PCR..
- Tối ƣu điều kiện cho phản ứng Real-time PCR.
- Tối ƣu điều kiện Real-time PCR với gene chuẩn IPP1.
- Tối ưu nồng độ mRNA trong phản ứng Real-time PCR.
- Kết quả điện di cho thấy, ở nồng độ mRNA khuôn là 100 ng/µL cho kết quả Real-time PCR tốt nhất..
- Kết quả Real-time PCR khi thay đổi nhiệt độ gắn mồi.
- Chúng tôi tiến hành phản ứng Real-time PCR với nồng độ mRNA 100ng/µL được tiến hành với chương trình chạy ban đầu có điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi từ 54°C lên 58°C, và nhận thấy ở nhiệt độ 58°C cho kết quả tốt nhất.Như vậy, đã thành công trong việc thiết lập chương trình và phản ứng Real-time PCR với gene chuẩn IPP1..
- Tối ƣu phản ứng Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1 3.4.
- Kết quả Real-time PCR với gene nội chuẩn IPP1.
- Trước khi tiến hành thí nghiệm với gene đích cần nghiên cứu là MF(ALPHA)1, chúng tôi đã thực hiện Real-time PCR nhằm nghiên cứu sự biểu hiện của gene nội chuẩn IPP1 trong các chủng control, Amy và IL-2 tại các thời điểm nghiên cứu 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ..
- Biểu đồ khuếch đại gene IPP1 của các mẫu trong Real-time PCR..
- Real-time PCR về biểu hiện của gene MF(ALPHA)1 3.5.1.
- Kết quả Real-time PCR đoạn gene MF(ALPHA)1.
- Kết quả cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính mức độ biểu hiện của gene MF(ALPHA)1 với mức độ biểu hiện của các gene ngoại lai (il-2 và amylase)..
- Cuối cùng chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm của phẩn ứng Real-time PCR bằng cách điện di trên gel agarose 1%.
- Phân tích so sánh mức độ biểu hiện gene MF(ALPHA)1 Thời.
- So sánh mức độ biểu hiện của gene theo thời gian lên men trong từng chủng..
- pastoris khi biểu hiện….
- So sánh mức độ biểu hiện của gen MF(ALPHA)1 theo thông số về chủng..
- So sánh kết quả Real-time PCR và Microarray.
- Phân tích Real-time PCR đều cho ra các kết quả khá tương đồng nhau về xu hướng biểu hiện của đoạn gene MF(ALPHA)1 ở các chủng nghiên cứu.
- Cụ thể là biểu hiện của chủng control tại các thời điểm rất thấp so với chủng Amy và IL-2..
- Đã tách chiết thành công các mẫu RNA tổng số phục vụ cho tiến hành thí nghiệm Real- time PCR.
- Đã tối ưu hóa thành công phản ứng và chương trình chạy Real-time PCR với 2 gene chuẩn là IPP1 và gene đích MF(ALPHA)1..
- Thiết lập thành công phản ứng Real-time PCR sử dụng SYBR GREEN I, trên hệ máy LightCycler 2.0 và phân tích trên phần mềm LightCycler 4.0 của Roche để định lượng tương đối sự biểu hiện phiên mã của tín hiệu tiết MF(ALPHA)1 trong các chủng tái tổ hợp sinh Amylase và Interleukin-2..
- Nghiên cứu mức độ biểu hiện ở cấp độ protein của các chủng P.
- Nguyên Văn Hùng (2010), PCR và Real-time PCR các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB Y học..
- Dorak MT (2006), Real-time PCR, Taylor &.
- Bengtsson M, Karlsson HJ, Westman G, Kubista M A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter dye for real-time PCR".Nucleic Acids Res, 31 (8), p.
- Bustin SA Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays".J Mol Endocrinol, 25 (2), p.
- Bustin SA Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems".J Mol Endocrinol, 29 (1), p.
- Caplan S, Kurjan J Role of alpha-factor and the MF alpha 1 alpha-factor precursor in mating in yeast".Genetics, 127 (2), p.
- Cereghino JL, Cregg JM Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris".FEMS Microbiol Rev, 24 (1), p.
- Cha HJ, Dalal NN, Bentley WE Secretion of human interleukin-2 fused with green fluorescent protein in recombinant Pichia pastoris".Appl Biochem Biotechnol, 126 (1), p.
- Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR Recombinant protein expression in Pichia pastoris".Mol Biotechnol, 16 (1), p.
- Daly R, Hearn MT Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production".J Mol Recognit, 18 (2), p.
- "Microarray-Based Transcriptome Analysis of Recombinant Pichia Pastoris Strains Overexpressing Alpha-Amylase and Interleukin-2".International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), 2 (1), p.
- Fuller RS, Sterne RE, Thorner J Enzymes required for yeast prohormone processing".Annu Rev Physiol, 50 p.
- Ginzinger DG Gene quantification using real-time quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream".Exp Hematol, 30 (6), p.
- Han MJ, Jeong KJ, Yoo JS, Lee SY Engineering Escherichia coli for increased productivity of serine-rich proteins based on proteome profiling".Appl Environ Microbiol, 69 (10), p.
- Jahic M, Veide A, Charoenrat T, Teeri T, Enfors SO Process technology for production and recovery of heterologous proteins with Pichia pastoris".Biotechnol Prog, 22 (6), p.
- Klein D Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations".Trends Mol Med, 8 (6), p.
- effects on alpha-factor production and mating".Mol Cell Biol, 5 (4), p.
- Kurjan J, Lipke PN Agglutination and mating activity of the MF alpha 2- encoded alpha-factor analog in Saccharomyces cerevisiae".J Bacteriol, 168 (3), p..
- Li P, Anumanthan A, Gao XG, Ilangovan K, Suzara VV, Duzgunes N, Renugopalakrishnan V Expression of recombinant proteins in Pichia pastoris".Appl Biochem Biotechnol, 142 (2), p.
- Liss B, Roeper J Correlating function and gene expression of individual basal ganglia neurons".Trends Neurosci, 27 (8), p.
- Michaelis S, Herskowitz I The a-factor pheromone of Saccharomyces cerevisiae is essential for mating".Mol Cell Biol, 8 (3), p.
- Murasugi A, Tohma-Aiba Y Production of native recombinant human midkine in the yeast, Pichia pastoris".Protein Expr Purif, 27 (2), p.
- "Engineering of promoter replacement cassettes for fine-tuning of gene expression in Saccharomyces cerevisiae".Appl Environ Microbiol, 72 (8), p.
- Peters IR, Helps CR, Hall EJ, Day MJ Real-time RT-PCR: considerations for efficient and sensitive assay design".J Immunol Methods p.
- Pfaffl MW A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR".Nucleic Acids Res, 29 (9), p.
- Radonic A, Thulke S, Mackay IM, Landt O, Siegert W, Nitsche A Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR".Biochem Biophys Res Commun, 313 (4), p.
- Svanvik N, Stahlberg A, Sehlstedt U, Sjoback R, Kubista M Detection of PCR products in real time using light-up probes".Anal Biochem, 287 (1), p.
- Trimble RB, Atkinson PH, Tschopp JF, Townsend RR, Maley F Structure of oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris".J Biol Chem p.
- A technique whose time has come".Science p.
- Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA, Rasmussen RP Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification".Biotechniques, 22 (1), p..
- implications for genetic engineering".Trends Biotechnol, 15 (1), p