- Cây Thạch tùng răng cƣa và hoạt chất Huperzin A. - Cây Thạch tùng răng cƣa. - Giới thiệu chung về cây Thạch tùng răng cƣa. - Thành phần hoạt chất có trong cây Thạch tùng răng cƣa. - Tình hình nghiên cứu về Thạch tùng răng cƣa và Huperzin A. - Các nghiên cứu về Thạch tùng răng cƣa. - Phƣơng pháp nghiên cứu. - Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số Thạch tùng răng cƣa. - Kết quả đánh giá đa dạng di truyền các mẫu Thạch tùng răng cƣa. - Kết quả định tính Huperzin A ở các mẫu Thạch tùng răng cƣa thu từ 8 địa điểm lấy mẫu. - Kết quả định lƣợng Huperzin A ở các mẫu Thạch tùng răng cƣa thu từ 8 địa điểm lấy mẫu. - Kết quả định tính Huperzin A từ các bộ phận và thời điểm lấy mẫu Thạch tùng răng cƣa khác nhau. - Kết quả định lƣợng Huperzin A từ 4 mẫu lá Thạch tùng răng cƣa. - Cây thạch tùng răng cƣa. - Kết quả điện di tách chiết DNA tổng số từ 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa. - Quan hệ di truyền giữa 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa nghiên cứu. - Hình ảnh chạy sắc ký bản mỏng Huperzin A từ 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa. - Hình ảnh chạy sắc ký bản mỏng Huperzin A từ Thạch tùng răng cƣa thu tại DL1. - Hình ảnh chạy sắc ký bản mỏng Huperzin A từ Thạch tùng răng cƣa thu tại SP1. - Kết quả đo độ hấp thụ bƣớc sóng 260 nm, 280 nm và nồng độ DNA tổng số của 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa nghiên cứu. - Tổng hợp kết quả phân tích 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa với 8 mồi RAPD cho đa hình. - Hệ số tƣơng đồng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa. - Kết quả phân tích định lƣợng 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa. - Kết quả phân tích định lƣợng Huperzin A trong mẫu Thạch tùng răng cƣa ở Sa Pa. - Huperzin A một chất thuộc nhóm Alkaloide có trong cây Thạch tùng răng cƣa có khả năng xuyên qua hàng rào mạch máu não và tác động trực tiếp lên não bộ với liều lƣợng rất thấp tính bằng microgram. - Chính vì vậy, theo các nhà khoa học, cây Thạch tùng răng cƣa cần đƣợc quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng trong điều trị các bệnh rối loạn về trí nhớ, nhất là Alzheimer. - Hoàn toàn chƣa có một công bố nào nghiên cứu về Thạch tùng răng cƣa trong nƣớc. - Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền và hàm lượng Huperzin A của loài Thạch tùng răng cưa thu từ Sa Pa và Đà Lạt” nhằm phục vụ cho việc khai thác và phát triển nguồn gen Thạch tùng răng cƣa ở Việt Nam. - Đánh giá đƣợc mức độ đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử của loài Thạch tùng răng cƣa sinh trƣởng tại Sa Pa và Đà Lạt, Việt Nam. - Nghiên cứu định tính và định lƣợng Huperzin A của Thạch tùng răng cƣa Việt Nam. - Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử RAPD với các xuất xứ Thạch tùng răng cƣa. - Xác định hàm lƣợng Huperzin A của Thạch tùng răng cƣa ở các thời điểm và ở các vùng sinh thái khác nhau. - Cây Thạch tùng răng cƣa và hoạt chất Huperzin A . - Cây Thạch tùng răng cƣa 1.1.1.1. - Giới thiệu chung về cây Thạch tùng răng cưa Cây Thạch tùng răng cƣa có tên khoa học là Huperzia serrata (H. - Cây thạch tùng răng cƣa LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI HV: Phạm Thị Hạnh_CB . - Thành phần hoạt chất có trong cây Thạch tùng răng cưa Trong Thạch tùng răng cƣa nhóm chất chính có hoạt tính sinh học làm nên đặc tính chữa bệnh của cây này là Lycopodium alkaloids. - Một số Lycopodium alkaloids với cấu trúc hóa học đa dạng đƣợc phân lập từ cây Thạch tùng răng cƣa vẫn đang đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu để xây dựng nên cấu trúc các hợp chất alkaloids mới. - Hoạt chất Huperzin A Hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cƣa là Huperzin A (Huperzine A). - một dạng viên của Huperzin A sản xuất từ chiết LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 6 xuất của Thạch tùng răng cƣa, đƣợc phát triển vào năm 1996 và nó đã đƣợc chấp nhận nhƣ là một loại thuốc mới để điều trị triệu chứng của Alzheimer ở Trung Quốc. - Mặc dù Huperzin A có nguồn gốc từ Thạch tùng răng cƣa nhƣng hợp chất này còn đƣợc tìm thấy ở nhiều loài khác có mối quan hệ phân loài gần gũi với loài Thạch tùng răng cƣa thuộc gia đình Huperziaceae. - Trong cây Thạch tùng răng cƣa có chứa Huperzin A ít hơn 0,02% trọng lƣợng tƣơi [6] [7] và trọng lƣợng khô, phụ thuộc vào mùa, vùng sinh sống, quá trình thu và công nghệ tách chiết [5] [12]. - Do đó muốn tách chiết đƣợc nhiều Huperzin A cần phải có một số lƣợng lớn cây Thạch tùng răng cƣa. - Chỉ thị phân tử RAPD Để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của các mẫu Thạch tùng răng cƣa thu đƣợc ngoài sử dụng đặc điểm hình thái thì việc áp dụng chỉ thị phân tử DNA đƣợc coi là phƣơng pháp hữu hiệu nhất. - Tình hình nghiên cứu về Thạch tùng răng cƣa và Huperzin A 1.3.1. - Các nghiên cứu về Thạch tùng răng cƣa Từ xa xƣa y học cổ truyền Trung Quốc đã sử dụng cây Thạch tùng răng cƣa trong các bài thuốc chữa nhiều bệnh liên quan đến chứng suy giảm trí nhớ, tâm thần LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 12 phân liệt, chống viêm...Nhƣng chỉ đến năm 1986, sau khi Liu và cộng sự phân lập thàch công Huperzin A chất chính làm nên dƣợc tính của của cây Thạch tùng răng cƣa thì nhiều nhà khoa học trên thế giới bắt đầu đặc biệt quan tâm nghiên cứu về loài cây này [20]. - LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 16 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. - Đối tƣợng nghiên cứu Tám mẫu Thạch tùng răng cƣa thu tại các địa điểm khác nhau ở Sapa và Đà Lạt đƣợc Vƣờn Quốc gia Hoàng Liên và Viện Sinh học Tây nguyên cung cấp. - Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. - Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số Thạch tùng răng cƣa LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 19 DNA tổng số đƣợc tách từ các mẫu lá theo phƣơng pháp của Saghai Maroof và cộng sự có cải tiến cho phù hợp với việc tách chiết DNA tổng số của lá Thạch tùng răng cƣa. - Tách DNA tổng số đƣợc tiến hành theo các bƣớc sau : Nghiền mẫu lá Thạch tùng răng cƣa trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. - Số liệu thu đƣợc từ các chỉ thị qua phản ứng PCR kết hợp với điện di đƣợc đƣa vào xử lý bằng phần mềm NTSYSpc version 2.02 để tính hệ số tƣơng đồng di truyền và xây dựng biểu đồ quan hệ di truyền giữa các mẫu Thạch tùng răng cƣa. - Phƣơng pháp tách chiết Huperzin A MẫuThạch tùng răng cƣa thu ở Sapa và Đà Lạt đƣợc sấy ở 50ºC và bảo quản ở nhiệt độ 25-26ºC. - Nghiền mẫu Thạch tùng răng cƣa trong thành bột với nitơ lỏng. - Mẫu lá Thạch tùng răng cƣa đƣợc cân để xác định khối lƣợng, sau đó đƣợc chiết trong MeOH với thể tích xác định, dịch chiết đƣợc lọc qua màng lọc trƣớc khi bơm vào hệ thống LC/MS. - LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 27 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. - Chúng tôi chọn phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số CTAB của Saghai Maroof có cải tiến dùng cho việc tách chiết DNA từ lá cây Thạch tùng răng cƣa. - Sản phẩm DNA tách chiết từ các mẫu lá Thạch tùng răng cƣa đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% đƣợc thể hiện ở hình 3.1. - Kết quả điện di tách chiết DNA tổng số từ 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa Ghi chú: 1: Mẫu SP1. - LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 28 Kết quả điện di trên hình 3.1 cho thấy, băng DNA tổng số của các mẫu Thạch tùng răng cƣa nghiên cứu đều sáng rõ nét, băng gọn, không có vệt kéo dài ở giếng và phía dƣới. - Điều đó cho thấy DNA tổng số của các mẫu Thạch tùng răng cƣa nghiên cứu có độ nguyên vẹn cao, ít đứt gẫy, DNA tách chiết đƣợc đủ tiêu chuẩn để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. - Kết quả đo độ hấp thụ bƣớc sóng 260 nm, 280 nm và nồng độ DNA tổng số của 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa nghiên cứu TT mẫu OD260nm OD280nm OD260/OD280 Nồng độ ADN (ng/µl Kết quả số liệu đo quang phổ hấp phụ của DNA cho thấy, tỷ số OD260nm/ OD280nm của 8 mẫu nghiên cứu đều nằm trong khoảng từ 1,8 – 2,0. - Kết quả đánh giá đa dạng di truyền các mẫu Thạch tùng răng cƣa Đa dạng di truyền là phƣơng thức tồn tại của các loài qua hàng ngàn năm tiến hóa. - Kết quả điện di sản phẩm PCR-RAPD với mồi OPB6 M LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 32 (M: marker;1: Mẫu SP1. - Sản phẩm của 64 phản ứng PCR thu đƣợc 36 loại phân đoạn DNA trong đó có 20 loại phân đoạn DNA đa hình từ 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa thu từ các địa điểm khác nhau. - Hệ số PIC trung bình của các mồi đƣợc sử dụng tƣơng đối cao (0,593) thể hiện sự đa dạng di truyền ở các mẫu Thạch tùng răng cƣa nghiên cứu là khá lớn. - Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền Dựa trên số liệu thu đƣợc từ phân tích 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa với các mồi RAPD và sử dụng phần mềm NTSYSpc version 2.02 để tính hệ số tƣơng đồng di truyền và xây dựng biểu đồ quan hệ di truyền giữa các mẫu, kết quả thể hiện trong bảng 3.3 và hình 3.6. - Hệ số tƣơng đồng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa Hệ số tƣơng đồng di truyền phản ánh quan hệ di truyền của các mẫu nghiên cứu với nhau. - Hệ số tƣơng đồng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa nghiên cứu dao động từ khoảng 0.526 đến 0.895. - Trong đó, cặp mẫu Thạch tùng răng cƣa DL1 và DL2, SP1 và SP3 có hệ số tƣơng đồng cao nhất (0.895). - Biểu đồ quan hệ di truyền hình 3.6 cho thấy 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa đƣợc chia làm 2 nhóm chính và hệ số tƣơng đồng di truyền giữa hai nhóm là 0,71. - Nhóm I: gồm các mẫu Thạch tùng răng cƣa thu ở Đà Lạt (DL1, DL2, DL3). - Nhóm II: gồm các mẫu Thạch tùng răng cƣa thu ở Sa Pa. - Quan hệ di truyền giữa 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa nghiên cứu Nhìn vào biểu đồ hình cây có thể thấy trong hai địa danh Nậm Cang và Tả Van ở Sa Pa có vị trí địa lý xa nhau hơn rất nhiều so với Tả Van và Lao Chải nhƣng kết quả phân tích đa dạng di truyền 2 mẫu thu tại Nậm Cang và Tả Van lại có mối quan hệ khá gần nhau. - Một số yếu tố có thể ảnh hƣởng đến sự đa dạng di truyền của Thạch tùng răng cƣa gồm: sự sinh trƣởng sinh dƣỡng (bộ gen bị đột biến trong quá trình phân chia tế bào), ảnh hƣởng của sự chọn lọc tự nhiên và lai xa và sự sinh sản hữu tính bằng cách phát tán bào tử của loài cây này. - Kết quả định tính và định lƣợng Huperzin A Sau khi nhận đƣợc kết quả đánh giá đa dạng 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa, nhiệm vụ tiếp theo đƣợc đặt ra là chọn mẫu có hàm lƣợng Huperzin A cao để tiếp tục sử dụng cho việc bảo tồn và nghiên cứu khai thác làm nguồn dƣợc liệu. - Nếu sử dụng mẫu Thạch tùng răng cƣa không đúng sẽ làm giảm hiệu quả của cây thuốc, khi LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 36 sản xuất thuốc sẽ ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời sử dụng. - Vì thế chúng tôi tiến hành đánh giá hàm lƣợng Huperzin A của 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa nghiên cứu nhằm chọn ra loại có hàm lƣợng cao nhất. - Kết quả định tính Huperzin A ở các mẫu Thạch tùng răng cƣa thu từ 8 địa điểm lấy mẫu Mẫu Thạch tùng răng cƣa sau khi thu về đƣợc làm khô ở 50oC rồi chiết Huperzin A bằng các phƣơng pháp tách chiết đã trình bày ở trên. - Tám mẫu Thạch tùng răng cƣa thu ở Đà Lạt và Sa Pađƣợc nghiền ni tơ lỏng với toàn bộ cây (rễ, thân và lá). - Kết quả định lƣợng Huperzin A ở các mẫu Thạch tùng răng cƣa thu từ 8 địa điểm lấy mẫu Dựng đường chuẩn định lượng Mẫu chất chuẩn đƣợc pha trong hỗn hợp dung môi MeOH thành các dãy nồng độ khác nhau sau đó tiến hành chạy HPLC để xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng. - Đƣờng chuẩn định lƣợng Huperzin A Định lượng Huperzin A từ 8 mẫuThạch tùng răng cưa: Huperzin A đƣợc tách chiết từ các mẫu Thạch tùng răng cƣa bằng MeOH với thể tích xác định. - Mẫu tách chiết từ Thạch tùng răng cƣa đƣợc bơm vào hệ thống sắc ký với các điều kiện phân tích đã đƣợc thiết lập ở trên.Tín hiệu của Huperzin A đƣợc phát hiện dựa vào sự trùng thời gian lƣu Rt giữa detector LC và detector MS và số khối MS so với chất chỉ thị. - Kết quả phân tích định lƣợng 8 mẫu Thạch tùng răng cƣa Mẫu phân tích Hàmlƣợngchấtchỉthị / mẫu (µg/g) SP1 19.620 SP2 5.582 SP3 6.284 SP4 9.428 SP5 11.907 DL1 85.416 DL2 8.605 DL3 104.231 Từ kết quả phân tích HPLC đã chọn đƣợc 4 mẫu Thạch tùng răng cƣa có hàm lƣợng Huperzin A cao nhất (SP1, SP5 và DL1, DL3). - Đối với các mẫu Thạch tùng răng cƣa thu ở Đà Lạt vào mùa Xuân và mùa Thu, mẫu sau khi thu đƣợc chiết ở cả 3 bộ phận rễ, thân và lá. - Điều này cho thấy, hàm lƣợng Huperzin A đƣợc tổng hợp nhiều LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 40 nhất trong lá Thạch tùng răng cƣa. - Nhƣ vậy có thể kết luận sơ bộ, đã chiết đƣợc Huperzin A từ mẫu lá cây Thạch tùng răng cƣa ở cả hai mùa Xuân và Thu, tuy dịch chiết vẫn còn lẫn nhiều tạp chất và lƣợng Huperzin A tách chiết từ mẫu lá mùa Thu nhiều hơn mùa Xuân. - Mẫu mùa Thu (1: Huperzin A chuẩn, 2: dịch chiết từ lá, 3: dịch chiết từ thân, 4: dịch chiết từ rễ) Đối với các mẫu Thạch tùng răng cƣa mùa Thu và mùa Xuân thu từ Sa Pa, vì hàm lƣợng Huperzin A nhỏ chúng tôi chỉ tiến hành tách chiết Huperzin A từ lá để chạy TLC (hình 3.10). - Để tiến hành định lƣợng Huperzin A trong mẫu Thạch tùng răng cƣa thu ở Sa Pa, chúng tôi tiến hành định lƣợng mẫu Thạch tùng răng cƣa mùa Thu bằng HPLC. - Kết quả định lƣợng Huperzin A từ 4 mẫu lá Thạch tùng răng cƣa Kết quả phân tích định lƣợng các mẫu lá Thạch tùng răng cƣa của Đà Lạt thể hiện trên hình 3.11. - Phổ ESI- MS positive và pic ion phân tử 243,0 [M+H]+ của Huperzin A Dựa vào đƣờng chuẩn định lƣợng chúng tôi tính đƣợc kết quả hàm lƣợng Huperzin A trong mẫu lá Thạch tùng răng cƣa mùa Xuân thu từ DL1 là 75,4 (µg.g-1 mẫu khô), mùa Thu là 92,5 (µg.g-1 mẫu khô). - Từ kết quả định lƣợng bằng phƣơng LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 43 pháp HPLC, có thể nhận thấy hàm lƣợng của Huperzin A trong mẫu lá Thạch tùng răng cƣa mùa Thu cao hơn so với mẫu mùa Xuân là 17,1 (µg.g-1 mẫu khô). - Kết quả định lƣợng hàm lƣợng Huperzin A trong mẫu lá Thạch tùng răng cƣa thu vào mùa Thu và mùa Xuân ở DL3 cũng cho kết quả hàm lƣợng Huperzin A thu vào mùa Thu cao hơn mùa Xuân. - Nhƣ vậy, ở các thời điểm khác nhau ở trong năm thì hàm lƣợng Huperzin A trong cây Thạch tùng răng cƣa là có sự khác nhau. - So sánh hàm lƣợng Huperzin A trong cây Thạch tùng răng cƣa ở Đà Lạt và ở Trung Quốc µg.g-1) cho thấy là gần tƣơng đƣơng nhau. - Cây Thạch tùng răng cƣa ở Đà Lạt có hàm lƣợng Huperzin A gần tƣơng đƣơng với loài này ở Trung Quốc và nhỏ hơn nhiều so với chi Huperziaceae nhƣng khác loài ở Australia và Philippines. - Định lượng Huperzin A từ mẫu lá Thạch tùng răng cưa thu tại Sa Pa: các mẫu Thạch tùng răng cƣa thu tại Sa Pa từ tháng 8 năm 2015 thu ở 2 địa điểm đƣợc sấy ở 50ºC và nghiền trong nitơ lỏng, tách chiết Huperzin A trong MeOH rồi tiến hành chạy LC/MS. - Kết quả phân tích định lƣợng Huperzin A trong mẫu Thạch tùng răng cƣa ở Sa Pa Mẫu phân tích Hàm lƣợng chất phân tích /mẫu (µg/g) SP1 12,571 SP5 11,304 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI HV: Phạm Thị Hạnh_CB141047 44 Từ kết quả định lƣợng hàm lƣợng Huperzin A cho thấy hàm lƣợng Huperzin A mùa Thu tại 2 địa điểm ở Sa Pa dao động trong từ 11,304 đến 12,571 µg/g, thấp hơn khoảng 9 lần hàm lƣợng Huperzin A thu vào mùa Thu tại Đà Lạt khi đƣợc thu và chiết xuất ở cùng điều kiện. - Đã định tính đƣợc Huperzin A trong các mẫu Thạch tùng răng cƣa thu tại Sa Pa và Đà Lạt bằng TLC chiết bằng HCl 0,5% và hệ dung môi chạy sắc ký chloroform- isopropanol- ethyl acetate- ammonia . - Định lƣợng Huperzin A bằng hệ thống LC/MS đã chọn đƣợc 4 mẫu Thạch tùng răng cƣa có hàm lƣợng Huperzin A cao nhất là SP1, SP5, DL1 và DL3. - MẫuThạch tùng răng cƣa tại Đà Lạt (mùa Thu 92,5µg.g-1 mẫu khô
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt