Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của aminoreductone với các chủng listeria monocytogenes phân lập từ thực phẩm

- Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những gì được thể hiện trong Luận văn này bao gồm nội dung nghiên cứu, kết quả nghiên cứu, số liệu thực hiện đều trung thực, được thực hiện bởi chính bản thân tôi, và chưa từng được công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đó.
- Hà Nội, ngày 22 tháng 9 năm 2016 Trương Thu Hằng Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 2 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS.
- Vũ Thu Trang, giảng viên Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm người đã tận tình hướng dẫn, góp ý động viên em trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này.
- Nguyễn Tiến Thành và Ths Lê Thị Lan Chi đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em có thể thực hiện tốt quá trình làm việc tại Trung Tâm Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học trong thời gian qua.
- Ngoài ra em cũng vô cùng biết ơn Ban lãnh đạo trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này.
- Em cũng xin đồng cảm ơn các thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học và Công Nghệ Thực phẩm – Đại Học Bách Khoa Hà Nội đã tạo điều kiện cho em được tốt nghiệp.
- Những lời cảm ơn sau cùng em xin dành cho bố mẹ, gia đình và bạn bè đã hết lòng quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn này.
- Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 22 tháng 9 năm 2016 Trương Thu Hằng Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 3 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.
- 1 LỜI CẢM ƠN.
- 6 DANH MỤC CÁC BẢNG.
- 7 DANH MỤC CÁC HÌNH.
- Tổng quan về phản ứng Maillard.
- 13 1.1 Lịch sử nghiên cứu về phản ứng Maillard.
- 13 1.1.1 Các giai đoạn phản ứng Maillard.
- 14 1.1.2 Các sản phẩm chủ yếu của phản ứng Maillard và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm.
- 19 1.2.2 Ứng dụng sự tạo thành Aminoreductone để kiểm soát quá trình gia nhiệt.
- Các đặc tính của Aminoreductone.
- 24 Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 4 1.2.4 Các nghiên cứu về các đặc tính của sản phẩm của phản ứng Maillard và hoạt tính kháng vi sinh vật của sản phẩm phản ứng Maillard.
- 25 1.3 Listeria monocytogenes.
- 29 1.3.5 Ảnh hưởng tới người và thực phẩm.
- 30 CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
- 33 2.1 Vật liệu nghiên cứu.
- Đối tượng nghiên cứu.
- Listeria monocytogenes.
- Địa điểm nghiên cứu.
- 36 Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 5 2.2 Phương pháp nghiên cứu.
- 37 2.2.1.Phương pháp tách chiết Aminoreductone.
- 37 2.2.2.Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.
- Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của Aminoreductone với vi khuẩn.
- Xác định khả năng diệt khuẩn của Aminoreductone bằng phương pháp killing assay.
- 48 3.1 Khảo sát khả năng ức chế L.monocytogenes của Aminoreductone (AR.
- 48 3.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của Aminoreductone (AR) đối với L.monocytogenes.
- 52 3.3 Khả năng diệt khuẩn của Aminoreductone (AR) đối với L.monocytogenes.
- So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với L.monocytogenes trong môi trường nuôi cấy và môi trường thực phẩm.
- 67 Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 6 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT  AR: Aminoreductone.
- MIC : Minimum Inhibitory Concentration ( Nồng độ ức chế tối thiểu.
- Concentration ( Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu.
- Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 7 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng Tên Bảng Trang 1 Bảng 2.1 Danh sách 30 chủng L.monocytogenes nghiên cứu được phân lập từ các sản phẩm thực phẩm 33 2 Bảng 2.2 Một số thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 35 3 Bảng 3.1 Kích thước đường kính kháng khuẩn của Aminoreductone đối với các chủng L.monocytogenes 48 4 Bảng 3.2 So sánh đường kính kháng khuẩn của Aminoreductone và một số kháng sinh đối với các chủng L.monocytogenes 50 5 Bảng 3.3 Nồng độc ức chế tối thiểu của Aminoreductone đối với các chủng L.monocytogenes 52 6 Bảng 3.4 Khả năng diệt khuẩn của Aminoreductone đối với các 8 chủng L.monocytogenes 54 7 Bảng 3.5 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với chủng M10XC2.1 ở môi trường MHB và môi trường sữa.
- 56 8 Bảng 3.6 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với chủng M10.2 ở môi trường MHB và môi trường sữa.
- 57 9 Bảng 3.7 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với chủng MXC2.2 ở môi trường MHB và môi trường sữa.
- 57 10 Bảng 3.8 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với chủng M50CP1.1 ở môi trường MHB và môi 58 Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 8 trường sữa.
- 11 Bảng 3.9 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với chủng M50CP3.1 ở môi trường MHB và môi trường sữa.
- 58 12 Bảng 3.10 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với chủng M50XCP1.2 ở môi trường MHB và môi trường sữa.
- 59 13 Bảng 3.11 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với chủng M4TH2 ở môi trường MHB và môi trường sữa.
- 59 14 Bảng 3.12 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với chủng M63.1 ở môi trường MHB và môi trường sữa.
- 60 15 Bảng 3.13 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR với 8 chủng thử nghiệm trong môi trường MHB và môi trường sữa 60 Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 9 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Hình Tên Hình Trang 1 1.1 Phản ứng ngưng tụ đường với acid amin 13 2 1.2 Phản ứng chuyển vị Amadori tạo ra 1-amin-1-dezoxy-2-xetoza 13 3 1.3 Phản ứng tạo thành furfurol và ozon 14 4 14 Phản ứng tạo thành reduction có 6 cacbon 15 5 1.5 Phản ứng phân hủy các hợp chất amin 16 6 1.6 Các sản phẩm của phản ứng Maillard 17 7 1.7 Quá trình hình thành Aminoreductone theo Pischetsrieder Quá trình hình thành Aminoreductone theo Shimamura Sơ đồ phản ứng của Lactose và hợp chất có chứa nhóm amin Sơ đồ phản ứng XTT Hình ảnh minh họa Listeria monocytogenes 26 12 2.1 Sơ đồ chuẩn bị dung dịch đệm phosphat 1,28M (pH 7.0).
- 36 13 2.2 Sơ đồ chuẩn bị dung dịch phản ứng 37 14 2.3 Mối tương quan giữa Aminoreductone và XTT.
- 38 15 2.4 Sơ đồ phương pháp XTT.
- 38 17 2.6 Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.
- 40 18 2.7 Các bước chuẩn bị môi trường chứa Aminoreductone.
- 41 Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 10 19 2.8 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của Aminoreductone với vi khuẩn 42 20 2.9 Hình ảnh minh họa kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của Aminoreductone với vi khuẩn Phương pháp xác định khả năng diệt khuẩn của Aminoreductone với L.
- monocytogenes 45 ĐẶT VẤN ĐỀ Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 11 Phản ứng Maillard là phản ứng hóa học xảy ra giữa acid amin và đường khử, có ảnh hưởng mạnh mẽ tới chất lượng sản phẩm.
- Nó tác động tới giá trị dinh dưỡng cũng như giá trị cảm quan của thực phẩm bởi vì phản ứng này là một trong những nguyên nhân chủ yếu làm thay đổi màu sắc, cấu trúc trong quá trình gia nhiệt, cũng đồng thời tạo ra các mùi hương đặc trưng như trong quá trình rang café, nướng bánh…….cùng lúc đó còn tạo một số sản phẩm không mong muốn.
- Ngoài ra hiện nay trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu xác nhận về việc hình thành các hợp chất có lợi khi xảy ra phản ứng Maillard như: hợp chất chống ung thư [26], hợp chất chống oxi hóa [28], hợp chất kháng khuẩn [29], khả năng chống cao huyết áp…[25] trong đó có những báo cáo về Aminoreductone tác dụng tương tự.
- Aminoreductone (AR) là một trong những sản phẩm của phản ứng Maillard, được hình thành sau một thời gian gia nhiệt ngắn, nên AR là chỉ số rất quan trọng để xác định mức độ phản ứng Maillard cũng như mức độ xử lý nhiệt trong sản xuất thực phẩm.
- AR được tách chiết dựa trên phương pháp của Shimamura [38].
- Hợp chất cũng được biết đến có hoạt tính chống oxi hóa [40], khả năng bảo vệ riboflavin dưới tác dụng của ánh sáng [46].
- Ngoài ra còn có những nghiên cứu cơ bản chứng minh khả năng chống lại một số chủng vi khuẩn gây bệnh tồn tại trong thực phẩm như : Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis [44].
- Qua các báo cáo như trên có thể thấy được hiệu quả kháng khuẩn của AR từ đây có thể thử thêm hoạt tính trên các chủng gây bệnh khác để làm rõ hơn khả năng diệt khuẩn của AR.
- Listeria monocytogenes là một vi khuẩn gây bệnh, Gram.
- [4] Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 12 Dựa trên kết quả nghiên cứu từ trước được công bố về sản phẩm của phản ứng Maillard gây ức chế gen gây độc đối với Listeria monocytogenes nhưng cũng không rõ ràng là hợp chất nào [20] và tới hiện nay vẫn chưa thấy có báo cáo liên quan tới khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes của AR.
- Với mong muốn tìm hiểu sâu sắc hơn nữa tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của Aminoreductone với các chủng Listeria monocytogenes phân lập từ thực phẩm.
- Trong phạm vi đề tài này, tôi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của AR trên chủng vi khuẩn gây bệnh : Listeria monocytogenes được phân lập từ các sản phẩm thực phẩm bằng phương pháp xác định vòng kháng khuẩn, xác định nồng độ ức chế tối thiểu, và khả năng diệt khuẩn với nội dung nghiên cứu sau : 1.
- Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Listeria monocytogenes của AR 2.
- Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của AR với vi khuẩn Listeria monocytogenes 3.
- Xác định khả năng diệt Listeria monocytogenes của AR đối với vi khuẩn Listeria monocytogenes 4.
- So sánh khả năng diệt Listeria monocytogenes của AR trong môi trường nuôi cấy và môi trường thực phẩm CHƯƠNG 1: TỔNG QU AN Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 13 1.
- Tổng quan về phản ứng Maillard 1.1 Lịch sử nghiên cứu về phản ứng Maillard Phản ứng Maillard xảy ra giữa acid amin và đường khử ( ví dụ như glucose, fructose, lactose), đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong kỹ thuật sản xuất thực phẩm.
- Phản ứng Maillard ảnh hưởng tới giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan của sản phẩm, chủ yếu làm thay đổi màu sắc, cấu trúc trong quá trình gia nhiệt, đồng thời tạo ra các mùi hương đặc trưng, ngài ra còn tạo ra một số sản phẩm phụ không mong muốn.
- Vì vậy tùy thuộc vào yêu cầu tính chất, cảm quan của từng sản phẩm mà người ta tăng cường hoặc kìm hãm các yếu tố liên quan để kiểm soát quá trình xảy ra phản ứng [1].
- Phản ứng Maillard được đặt tên theo nhà hóa học người Pháp Louis - Camille Maillard người đầu tiên phát hiện ra phản ứng.
- Năm 1912 trong lúc Maillard đang cố gắng tìm cách tổng hợp protein sinh học trong ống nghiệm, thời điểm hợp chất hình thành mùi và màu sắc đã khiến ông liên tưởng tới các phản ứng hóa học xảy ra trong thực phẩm.
- Cũng cùng năm đó, ông công bố những dữ liệu ban đầu liên quan tới thành phần hóa học đồng thời dự đoán về khả năng ứng dụng của hợp chất trong nhiều lĩnh vực như khoa học, sinh học thậm chí liên quan tới bệnh lý của con người.
- Luận điểm này đã bị bác bỏ bởi cộng đồng nghiên cứu khoa học cho tới tận năm 1941, cuối cùng vào năm 1948 phản ứng Maillard được thừa nhận chắc chắn là nguyên nhân tạo màu nâu và làm giảm giá trị dinh dưỡng trong sữa bột [17].Sau đó rất nhiều bài báo cáo đã đề cập tới những phản ứng phức tạp xảy ra và bằng nhiều phương thức khác nhau để đánh giá sự ảnh hưởng từ các thông số ( pH, nhiệt độ, thời gian, đường phản ứng, nồng độ các chất, hoạt độ nước…) cùng với sự thay đổi chất lượng thực phẩm, dinh dưỡng, tổn thất Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 14 acid amin cần thiết, sự trao đổi chất trong sản phẩm phản ứng, tác dụng sinh lý khi ăn các sản phẩm của phản ứng Maillard [28].
- 1.1.1 Các giai đoạn phản ứng Maillard Dựa vào mức độ màu sắc của các sản phẩm có thể chia thành 3 giai đoạn kế tiếp nhau như sau.
- Giai đoạn đầu: sản phẩm không màu và không hấp thụ ánh sáng tia cực tím.
- Giai đoạn đầu - Phản ứng ngưng tụ cacbonylamin Giai đoạn đầu tiên của phản ứng Maillard là sự ngưng tụ đường với acid amin.
- Trong điều kiện nhiệt độ sinh lý thì tạo thành base Schiff (Hợp chất hữu cơ có nhóm - HC=N.
- Hình 1.1 Phản ứng ngưng tụ đường với acid amin - Phản ứng chuyển vị Amadori.
- Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 15 Khi ở nhiệt độ cao phức đường amin bị đồng phân hóa hay còn gọi là chuyển vị nội phân Amadori.
- Kết quả là giữa nguyên tử thứ nhất và thứ 2 sinh ra nối kép tạo thành 1 – amin – 1 – dezoxy – 2 – xetoza.
- Hình 1.2 Phản ứng chuyển vị Amadori tạo ra 1-amin-1-dezoxy-2-xetoza Phẩm vật của sự chuyển vị Amadori là hợp chất có khả năng phản ứng và là chất khởi đầu để tạo thành polymer có màu sẫm gọi là melanoidin.
- Tùy điều kiện môi trường và nhiệt độ mà tạo thành sản phẩm phân ly khác nhau.
- Tạo thành furfurol và ozon.
- Hình 1.3 Phản ứng tạo thành furfurol và ozon - Tạo thành reductone có 6 cacbon.
- Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm Đại Học Bách Khoa Hà Nội 16 Các aminodezoxyxetoza được tạo thành khi chuyển vị Amadori có thể bị khử đi 2 phân tử H20 để tạo thành reductone có 6 cacbon.
- Reductone là những hợp chất hữu cơ có tính khử mạnh do có mặt nhóm endiol, thường nhóm này được liên kết với gốc aldehyde hoặc gốc acid.
- VD: Reductone đơn giản nhất là triozoreductone Hình 1.4 Phản ứng tạo thành reduction có 6 cacbon - Phân hủy các hợp chất amin Base Schiff được tạo thành bị phân ly thủy phân thành aldehyde và hợp chất amin, chất này cho các phẩm vật chứa nito và có màu nâu sau này:

Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn
hoặc xem Tóm tắt