- Nghiên cứu khả năng gắn của phức hợp nimotuzumab'131! với tế bào A549 invitro và nghiên cứu tác dụng kháng ung thư phồi không tế bào nhỏ trên mô hình chuột nude đữợc ghép tế bao A549 (UTPKTBN), chúng tôi rúí ra được một sổ kết luận sau:. - s ử DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG DNA PHÔI THAI TRONG HUYÉT TƯƠNG THAI PHỤ. - Việc phắt hiện ra DNA phôi thai tự do trong huyết tương mẹ năm 1997 đă mờ ra khả năng m ới cho chần đoốn trước sinh không xâm lấn. - Nghiên cứu của các tác giả cho thấy nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyểt tương thai phụ tăng tương ứng với tuổi thai và được tăng lên một cách có ý nghĩa tròng thai ky có liên quan đến: sinh non, tiền sản giật, trisomy 21, /3 -thalasemie. - Hiện tại, chưa có bậc thang nồng độ thương mại của DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ được xây dựng để s ù dụng trong kỹ thuật Realtime PCR, mục tiêu:i. - Xây dựng được đường chuẩn sử dụng trong kỹ thuật Realtime PCR định lượng DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ. - ĐĨnh lượng được nồng độ DNA phôi thai tự do trvng huyet tương thai phụ bình thường. - Định lượng được nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ tiền sản giậtC hất liệu nghiên cứu: 5ml mâu cửa thai phụ bình thường (30 thai phụ/lần tại cốc thời điểm tuần: 12-14. - 31-35 và 30 thai phụ tiền sản giật). - Phương pháp nghiên cứu: Tàch chiết DNA từ huyết tương thai phụ bình thường và thai phụ tiền sản giật, tạo minigene nồng độ 1012, thiết kế primer và probe trên đoạn gen chuẩn bị cho real time PCR, chạy PCR để kiểm tra DNA chiết tâch và định lượng đường chuẩn, chạy real time PCR. - Kết quả:1.. - Đã xây dựng và hoàn chỉnh được đường chuẩn đinh lượng DNA phôi thai tự do lưu hành trong tuần hoàn thai phụ. - Đã định lượng DNA phôi thai tmng huyết tương thai phụ bình thường 3. - Đã định lượng DNA phôi thai trong huyết tương thai phụ tiến sản giật. - Nong độ DNA phôi thài tầng dần theo tuồi thai có ý nghĩa thống kê. - Bước đầu thấy nồng độ DNA phôi thai tăng có ý nghĩa d ự đoán tiền sản giật.. - Từ khóa: DNẠ phôi thai tự do, Realtime PCR, huyết tương thai phụ, tiền sản giật.. - To set up a baseline fo r using Realtime PCR to quantify the cell-free fetal DNA in plasma o f pregnant women. - DNA phôi thai tự do lưu hành trong tuần hoàn thai phụ ià một dấu ấn sinh học phân tử, được phát hiện đầu tiên nhờ nghiên cứu của Lo và c s 1997, việc phát hiện được DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ đã mở ra kha năng mới cho chan đoán trước sinh khổng xâm ỉẩn. - Nghiên cứu của các tác giả cho tháy nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ tăng tương ứng với tuổỉ thai và nòng độ DNA phôi thai tăng cao bat thường íiên quan đến các biển chứng của thai kỳ như: sinh non, tiền sản giật, trisomy 21, p- ỉhalasemie. - Kỹ thuật Realtime PCR khuyếch đại DNA đích mà có bản saò được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR nó cho phép định lượng chính xấc nồng độ của DNA thai, viẹc xử lỷ dữ liệu và tính toán phụ thuộc vào đường biểu diễn chuẩn (Standard curve). - Hiện tại, chưa có bậc thang nồng độ thương mại của DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ được xây đựng để sừ dụng trong kỹ thuật Realtime PCR, vì vậyT chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm mục tiêu:. - Xây- dựng đường chuẩn s ử dụng trong kỹ thuật Realtime PCR định luụng DNA phôi thai trong huyết tương thai phụ. - Định luựng được nồng độ DNA phôi thai tự do trong hủyểt tương thai phụ bĩnh thường. - ĐÍnh lượng được nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ tiền sản giật.. - Đối từợng nghiên cứu. - Chất liệù nghiên cứu: 5ml máu của thai phụ được lấy vào ống EDTA, ly tâm tách huyết tương và bao quản ở -800C đến khi sử dụng.. - Nhóm chứng: 02 mẫu máu của thai phụ mang thai phụ khi chuyển dạ đẻ và sau đẻ biết giới tính của con:. - chọn 01 thai phụ mang thai nam và 01 thai phụ mang thai nữ.. - Nhóm thai phụ bình thường: 30 mẫu máu ở tuần:. - được sản phụ cho đến khi sinh con để biểt được tình trạng của con, đồng ý và tự nguyện tham gia nghiên cứu.. - Nhóm thai phụ tiền sản giật: Mẫu máu của 30 thai phụ được chẩn đoán tiền sản giật có 2 trong 4 các triệu chứng sau trờ lên: siêu âm. - Tiến hành tạo minigene nồng độ 1012, thiết kế primer và probe, tiển hành chạy PCR để kiểm tra DNA chiết tách và định lượng đường chuẩn, tiến hành chạy Realtime PCR định lượng DNA phôi thai.. - Kỹ thuật sử dụng: kỹ thuật chiết tách DNA phôi thai (theo quy trình của I Randen và c s (2003. - kỹ thuật PCR lông, kỹ thuật Realtime PCR.. - Kỹ thuật Realtime PCR: Nguyên liệu: Standard cuve đã ổược pha loãng theo các nồng độ từ 1012 đến 100, chứng ấm, chứng dương, DNA phôi thai trong huyết tương thai phụ cần định lượng. - KẾT QUẢ. - Chúng tôi tiến hành xây đựng đường chuẩn cho Realtime PCR và định lượncj nồng độ DNA phôi thai trong huyết tương thai phụ bang cặp mồi và probe trên gen SRY, thu được kết quả sau.. - Kết quả xây dựng đường chuẩn cho kỹ thuật Realtime PCR cho nghiên cứu - Tiến hành tạo minigene nồng độ 1012. - Tiến hành PCR lồng để kiểm tra primer và nồng độ chuẩn Sau thiết kế, sau đó điên di để kiểm íra DNA.. - DNA thai phụ mang thai nữ, Rãnh 7,1 1 . - DNA thai phụ mang thai nam, Rãnh 8. - Kiểm tra đường chuẩn: ỉiến hành đo OD mẫu chuẩn, tính toán nồng độ 1011 theo định luật Avogadro từ đó tính độ pha loãng, xây dựng đường chuan và chạy thử trên máy Realtime.. - PCR kiểm tra DNA trong mẫu chứng nam, chứng nữ và trong các mẫu theo bậc ỉhang nồng độ.. - Chú thích: M - Marker, Giếng 1 - Chứng DNA nữ, Giếng 2 - Nước cất, Giếng 3 - Chứng DNA nam, Giếng 4 - Chứng DNA của thai phụ mang thai nam, Giếng 5 -1 4 - mẫu chuẩn nồng độ từ 101 -108. - Nhận xét: sử dụng PCR để bán định lượng đường chuẩn sử dụng cặp moi Y15, Y16 và Ỷ17, Y18 để kiểm tra, cho sản pham 198bp và đường chuẩn lên sản phẩm phụ thuộc vào nồng độ DNA. - Tiến hành chạy Realtime PCR: Kết quả sau khi chạy đường chuẩn cùa gen SRY trong mẫu chuẩn pha loãng ở các nồng độ . - Định lượng nồng độ DNA phôi thai trong huyểt tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR từ đường chuẩn đã xây dựng được.. - DNA phối thai sau khi được chiết íách từ huyết tương thai phụ binh thường và thai phụ tiền sản giật, chúng tôi tiến hành chạy PCR lồng với cặp mồi cua gen SRY để kiểm tra sấn phẩm sau chiết tách, sau đó tiến hành định lượng DNA.. - Nồng độ DNA phôi thai trung bình ờ các quý của nhóm thai phụ binh thường. - Nồng độ DNA phôi thai trung binh (copy/m!). - Nồng độ DNA phôi thai dao. - Nhận xét: Nồng độ DNA trung bình của nhóm thai phụ bình thường tăng dần theo các quý của thai kỳ với p<0,05.. - Nồng độ DNA phôi thai trung bình ờ các quý của nhóm thai phụ tiền sản giật. - Nồng độ DNA phôi thai truna bình. - Nồng độ DNA phôi thai dao độna (min. - Nhận xét: Nong độ DNA trung bình cùa nhóm thai phụ tỉền sản giật tăng cao theo các quý của thai kỳ với p<0,05.. - So sánh nồng độ DNA phôi thai giữa nhóm thai phụ bình thường và thaỉ phụ tiền sản giật ở quý 3 của thai kỳ______. - Nông độ DNA ờ nhóm thai phụ bình thường. - Nông độ DNA ở nhổm thai phụ tiền sản giật. - 0,05 Nhận xét: Nồng độ DNA phôi thai ở nhóm thai phụ tiền sản giật cao hơn nhóm thai phụ bình thường có cùng tuổi thai tương ứng vởi p<0,05.. - Chúng tôi sử dụng sự khác biệt này để xác định các DNA phôi thai tróng huyết tương của thai phụ mang thai nam, do vậy chúng tôi đã nhân bản, trình tự từ ngân hàng gen sau đó sử dụng các trinh tự này để kiểm tra việc thiết kế mồi và probe. - Khi thư PCR lần 1 với các cặp mồi X1X3 và PCR lồng với cặp mồi X2X3 để kiểm tra các gen của NST X trên các mẫu chứng và DNA chiết tách từ huyết tương thai phụ thì tầt cả các mẫu đều có sản phẩm PCR 261bp, chứng íỏ DNA chiết tách từ huyết tương thai phụ đảm bảo chất lượng cho việc phát hiện SRY. - Các mẫu DNA chiết tách từ chửng nam binh thường và từ huyết tương thai phụ sinh con trai đều có sản phẩm với đôi mồi nảy, còn các mẫu huyết ìương lấy từ huyết tương thai phụ sinh con gái và DNA chứng nữ bình thường thì không. - Kết quả PCR đã chứng minh rang trong huyết tương thai phụ có mặt DNA của NST Y của thai. - Từ kết quả này chúng tồi kiểm tra iại đoạn gen bằng các primer và probe với minigene (standard curve), chủng tôi pha loãng và tính toán đỗi từ ng/ml sang số copies/ml theo định íuật Avogadro.Kết quả thực hiện phản ứng Realtime PCR của gen SRY trong nghiên cứu cho tín hiệu tốt với:. - hiệu quả khuyếch đại đạt cao và mức độ đồng nhất qua các íần phản ứng lặp iại [2], Vì vậy, có thể ứng dụng phương pháp này trong cac nghiên cứu tiểp theo.. - Chúng tôi tiến hành định lượng DNA phôi thai trong huyết tương thai phụ bình thường bằng kỹ thuật. - Đối vơi nhóm thai phụ tiền san giật, nồng ổộ DNA trúng b)nh ở quý copy/mi copy/ml) và ờ quý copy/mí copy/mi). - Điều này chứng tỏ có DNA phôi thai tự do lưu hành trona tuần hoàn thai phụ và có xu hướng tăng dần theo tuổi thai, đồng thời sự thay đổi nồng độ DNA phôi thai tự do tăng cao trong huyết tương thai phụ tiền sản giật so với thai phụ bình thường có cùng tuổi thai tương ứng với p<0,05.. - Theo Lo và c s (1999), DNA phôi thai xuất hiện trong huyết tương, huyết thanh mẹ từ 3 tháng đầu và nồng độ tăng cùng với tuổi thai (có thể được giải thích bời sự iăng diện tfch của rau thài) và tăng đột ngột vào gần cuối thai kỳ, đặc biệt ià sau tuần thai thứ 32 (đó có thể ià kết quả của quá trình chuẩn bị sinh nở) và nồng độ trung bình của DNA phôi thai írong huyết tương mẹ trong 3 tháng giữa và 3 ỉháng cuối tương ứng là 3,4%. - và 6,2% DNA tổng số trong huyết tương mẹ [7], Nhĩeu nghiên cứu trước đó (Smid và c s 1997, Lo và cs c s , 1998. - Honda và c s , 2002) cũng thấy tồn tại mối liên quan giữa số lượng DNA phôi thai tự do trong tuần hoàn mẹ với tuổi thai. - Nghiên cứu của Invernizzi và c s (2002) ở 685 thai phụ bình thường mang thai nam kết quả: nồng độ DNA phôi thai trung bình dao động 21,6-9,3 copy/mi ở quý 1. - Nghiên cứu của Aí Nakib M. - tuần 28 là 728,5 copy/ml copy /ml), nồng độ DNA tăng dần theo tuằi thai [1. - Nghiên cứu của Zhong XY và c s (2004) ở 3 nhóm thai phụ mang thai bình thường gồm 19 thai phụ sống ở vùng biển, 21 thai phụ nhóm người Hán di cư sống ở độ cao thẩp và 27 thai phụ người Tây Tạng thuộc vùng núi cao kết quả cho thấy nồng đọ DNA tương ứng trong huyết tương thai phụ lần iượt như sau: 22,5 copy/ml copy/ml). - 90 copy/ml copy/mi) và 76,5 copy/mi I copy/ml), như vậy đối với những thai phụ sống ở các đọ cao khác nhau ảnh hường tới sự có mặt của DNA phôi thai tự do, ờ những thai phụ song ờ độ cao càng cao thì nồng độ DNA phôi thai tự do lưu hành trong huyết tương thai phụ bỉnh thường càng tăng tác giả lý giải rằng do phải sống trong điều kiện thiếu oxy dẫn íới nhau thai phải điều Chĩnh đề đảm bảo cho thai phát triền thuận lợi [10], Như vậy, ở các khu vực địa lý khác nhau thì nồng độ DNA phôi thai tự do lưu hành trong huyết tương thai phụ sẽ khác nhau.Trong nghiên cứu này, nồng độ DNA phôi thai trong kết quả của chứng tôi ở. - nhóm thai phụ bình thường và thai phụ tiền sản giật cao hơn nghiên cứu của các tác giả trên điều đó có thể do thai phụ ở các khu vực địa lý khác, quy trình Ịỵ tâm mẫu máu khác nhau bao gồm cả thể tích huyết tương của thai phụ và lượng DNA chiết tách và lượng DNA khuếch đại va phần lớn phụ nữ mang thai ờ Viẹí Nam đều có tỉnh trạng thiếu máu dẫn tới bánh rau bị phá hủy làm có lẽ nó cũng góp phần !àm tăng nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương của thai phụ binh thường và thai phụ tỉền sản giật đặc biệt íà tăng cao ở nhóm thai phụ tiền sản giật. - Nồng độ DNA phôi thai của chúng tôi phù hựp với nghiên cứu cùa tác giả Zhong và c s (2001) điếu này có thể do kích íhLPỚc bánh rau, tình trạng thiếu máu, dinh dưỡng, chế độ ăn liên quan đến chủng tộc làm cho nồng độ DNA phôi thai ơ người Châu Á cao hơn ở người Châù Âu.. - Tiền sản giật là một bệnh lý phức tạp írong thai kỳ được đặc trưng bởi tinh trạng tăng huỹết áp và xuất hiện protein niệu từ tuần 20 cua thai kỳ trở đi ở người phụ nữ trước đây có huyết áp bình thường. - Năm 2014, Martin A và CS nghiên cứu tồng quan cho thấy ở 13 nghiên cứu thì 11 nẹhiên cứu đã chứng minh rằng ở nhưng íhai phụ cổ nong độ DNA phôi ìhai tự do tăng cao, thai phụ sau đó đã phát triển tiền sản giật, ngoài ra, kết quả của bốn nghiên cứu đã chứng minh thấy nồng độ DNA phôi thai tăng cao đáng kể trước khi khởi phát tiền sản giật [8]. - Một số yếu tố nguy cơ ổược cho là làm tăng nguy cơ phát triển tiền sản giật: bệnh mạch máu của người mẹ, rối loạn tự miễn dịch, nguyên nhân di truyền, đái tháo đường, mang thai đôi. - Theo nghiên cứu của Lo và CS, hầu hết những phụ nữ đã được nghiên cứu (7 trong số 8 phụ nữ) không phát hiện được nồng độ DNA phôi thai iuấn hoàn sau sinh 2 giờ [7]. - Như vậy, nồng độ DNA phôi thai tự do là một marker sinh học nhiều tiềm năog và sự tăng nồng độ cùa nó có liên quan đến các giai đoạn của quá trình thai nghén và tăng cao trước khi có triệu chứng lâm sàng của tiền sản giật và với tốc độ giải phóng và thải trừ nhanh chóng, số lượng DNA phôi thai đã cung cấp một bức tranh toàn cảnh và chi tiết theo thời gian về sự sản xuất và thải trừ DNA phôi. - Đã xây dựng và hoàn chỉnh được đường chuẩn định lượng DNẦ phôi thai tự do ÍIPU hành trong tuần hoàn thai phụ.. - Nồng độ DNA trung bỉnh ờ nhóm ìhai phụ binh thường. - Nồng độ DNA trung binh ở nhóm thai phụ tiền sản giật. - Quy copy/ml (dao động trong khoảng copy/ml). - Quý copy/ml (dao động írong khoảng copy/ml). - Nồng độ DNA phôi thai ở nhóm thai phụ tiền sản giật cao hơn so với nhóm thai phụ bình thường có cùng tuổi ỉhai tương ứng với p<0,05.. - Nếu trên iâm sàng và siêu âm Doppler, thai phụ có các dấu hiệu nguy cơ của tiền sản giật từ tuần ỉhư 12 nên kết hợp định lượng nồng độ DNÀ phôi thai trong huyết tương thai phụ giúp theo dõi và phát hiện sớm tiền sản giật.
Xem thử không khả dụng, vui lòng xem tại trang nguồn hoặc xem
Tóm tắt