- Nhằm mục đích cải tiến chất lượng chao tuyền thống, nghiên cứu về sản xuất tối ưu bột bào tử nấm mốc Actinomucor elegans để ứng dụng vào quy trình sản xuất chao đã được tiến hành. - Kết quả cho thấy mật số bào tử A. - elegans đạt cao nhất (10 10 bào tử/g cơ chất khô) với nghiệm thức gồm cơ chất tấm và cám gạo tỉ lệ 2:1, chủng 10 5 bào tử/gck và thu hoạch sau 6 ngày ủ ở 30 o C. - Nhiệt độ, thời gian sấy, và thời gian xay tối ưu cho số lượng bào tử sống lần lượt là 42 o C, 48 giờ và 1 phút. - Sau 5 tháng bảo quản, mật số bào tử sống còn duy trì tối đa là 88,57% ở nghiệm thức bảo quản ở 4 o C (trong tủ lạnh) trong túi nhựa polypropylen, bào tử sống của nó giảm đi 2,2% so với mẫu ban đầu (90,77. - Dựa trên những số liệu tối ưu thu được từ các thí nghiệm, một quy trình sản xuất giống bột bào tử mốc (mật số cao) và bảo quản tối ưu (bào tử sống duy trì cao nhất) đã được thiết lập. - Kết quả giống bột bào tử mốc A. - Hiện nay, chủng nấm mốc Actinomucor elegans thuần chủng đã được phân lập và sản xuất ra giống mốc bột bào tử để áp dụng vào quy trình sản xuất chao trên quy mô công nghiệp ở các nước như Đài Loan, Trung Quốc. - Chuẩn bị dịch trích bào tử: cho 5ml nước cất vô trùng vào mỗi ống thạch nghiêng. - Dùng kim cấy vô trùng trích bào tử vào dung dịch sao cho thu được mật số 10 7 bào tử/ml dịch trích. - Quy trình chung nghiên cứu sản xuất giống bột bào tử nấm mốc. - Trong nghiên cứu sản xuất starter bào tử nấm mốc A. - Hình 1: Quy trình chung sản xuất bột bào tử nấm Actinomucor elegans. - Chủng dịch trích bào tử vào cơ chất sao cho đạt mật số mong muốn và 10 3 bào tử/gck. - 2.2.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp để cho sản lượng bào tử cao nhất. - Mục đích: Tìm ra tổ hợp (thành phần cơ chất, mật số bào tử chủng và thời gian nuôi cấy) tốt nhất để đạt sản lượng cao nhất bào tử Actinomucor elegans.. - Xác định số lượng bào tử tổng số: Phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu Bürk-Türk (Thanh và Nout, 2004). - Cân 1g cơ chất chứa bào tử cho vào 99ml nước cất vô trùng. - Dịch trích bào tử được khuấy mạnh và lọc bằng màng lọc Millipore. - Dịch trích bào tử được pha loãng với mật số thích hợp và được đếm bằng buồng đếm Bürk-Türk. - Sau khi đếm số bào tử trên buồng đếm, tính bào tử tổng số/g cơ chất tươi theo công thức: N= [(a/b) x x 103 x 10n.. - 2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy mẫu đến số lượng bào tử sống. - Mục đích: Tìm ra nhiệt độ, thời gian sấy khô mẫu thích hợp nhằm hạn chế thấp nhất sự tổn thương gây ra do nhiệt độ và cơ học đến khả năng sống của bào tử.. - Chuẩn bị nguyên liệu: Từ kết quả của thí nghiệm trước, nghiệm thức tốt nhất được chọn để tiến hành trong thí nghiệm này với lượng bào tử chủng vào là 10 5 /gck, thời gian ủ là 6 ngày.. - Xác định số lượng bào tử tổng số: như trên (Thanh và Nout, 2004).. - Xác định số lượng bào tử sống, chết và miên trạng: Phương pháp huỳnh quang với chất cFDA và PI: Dịch trích bào tử được rửa hai lần (bằng dung dịch đệm phosphate pH=4) bằng cách ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút. - Dưới kính hiển vi huỳnh quang, bào tử sống phát ra huỳnh quang xanh với cFDA, bào tử chết phát ra huỳnh quang đỏ với PI.. - Cách tính số lượng bào tử tương tự như cách tính bào tử tổng số.. - 2.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng xay mẫu và thời gian xay đến số lượng bào tử sống. - Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xay mẫu đến số lượng bào tử sống, chết và miên trạng của bào tử A. - elegans, nhằm tìm ra thời gian xay mẫu thích hợp hạn chế thấp nhất sự tổn thương cơ học gây ra có ảnh hưởng đến khả năng sống của bào tử.. - Xác định số lượng bào tử sống, chết và miên trạng bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang (Thanh và Nout, 2004), mẫu trước và sau xử lý.. - Xác định số bào tử sống trên môi trường RBCC.. - 2.2.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tồn trữ đến mật số bào tử sống, chết và miên trạng theo thời gian. - Mục đích: Nhằm tìm ra sự ảnh hưởng nhiệt độ và dụng cụ bảo quản đến khả năng sống của bào tử theo thời gian.. - Từ kết quả thu được ở thí nghiệm 1, 2 và 3 chọn được nghiệm thức tốt nhất với các nhân tố tối ưu để sản xuất lượng lớn bào tử để sử dụng cho thí nghiệm này.. - Xác định số bào tử sống bằng phương pháp huỳnh quang (Thanh và Nout, 2004): 1 lần mỗi tháng.. - Bên cạnh đó sản lượng bào tử có khuynh hướng đạt giá trị cao khi chủng với lượng bào tử cao và thời gian ủ 6 ngày.. - Đáng chú ý nhất là ở nghiệm thức 17: tấm: cám (2:1), chủng 10 5 bào tử/gck. - 6 ngày ủ cho sản lượng bào tử cao nhất là Log 10 bào tử/gck bào tử/gck).. - Bảng 1: Sản lượng bào tử theo các nghiệm thức Nghiệm. - Tổ hợp các yếu tố Sản lượng bào tử. - Log 10 bào tử/gck ) Loại cơ chất (tỉ lệ). - Tấm : Cám Lượng bào tử chủng/gck. - Wang và Hesseltine (1975) sản xuất lượng lớn bào tử Rhizopus oligosporus trên cơ chất tấm gạo và lúa mì đạt sản lượng 10 9 /gck. - (1984), nấm mốc Penicilliun roqueforti nuôi cấy trên môi trường bán rắn, sản lượng bào tử chỉ đạt được 10 8 bào tử/gck. - Kết quả phân tích thống kê cho thấy sản lượng Log 10 bào tử/g bào tử/gck) của nghiệm thức 17 là cao nhất và khác biệt với các nghiệm thức còn lại ở mức 5% (p<0,05). - 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến số lượng bào tử sống. - Kết quả thu được sản lượng bào tử Log 10 bào tử/g = 10,15 (Bảng 2).. - Kết quả ở bảng 2 cho thấy lượng bào tử sau khi sấy giảm một ít do hao hụt. - Số lượng bào tử sống trong thí nghiệm được xác định bằng 2 phương pháp: đếm sống và huỳnh quang. - Phương pháp đếm sống khuẩn lạc trên môi trường RBCC cho thấy số lượng khuẩn lạc luôn cao hơn số lượng bào tử tổng số, trong khi đó phương pháp huỳnh quang cho kết quả số lượng bào tử sống nhỏ hơn một ít hơn so. - với bào tử tổng số tương ứng (do một số bào tử chết và miên trạng). - Kết quả chỉ ra phương pháp huỳnh quang cho kết quả bào tử sống tốt hơn phương pháp đếm sống truyền thống. - Nguyên nhân đã được giải thích là đếm sống trên RBCC không chỉ bào tử mà cả các khuẩn ty cũng tạo nên khuẩn lạc làm cho số lượng cao hơn tổng số bào tử. - Bảng 2: Số lượng bào tử sống và chết sau khi sấy mẫu. - Bào tử tống số ( Log 10 bào. - Bào tử sống (2). - Log 10 bào tử/g. - Bào tử chết (3). - Log 10 bào tử/g ) nhiệt độ. - (1) Xác định số bào tử sống trên môi trường Rose Bengal Cloramphenicol. - (2) Xác định số bào tử sống bằng phương pháp đánh dấu huỳnh quang cFDA. - (3) Xác định số bào tử chết bằng phương pháp đánh dấu huỳnh quang PI.. - Trên cơ sở đó, số liệu kết quả từ phương pháp huỳnh quang ở Bảng 2 cho thấy số lượng bào tử sống: 96,48% của nghiệm thức (NT) 1 (42°C, 24 giờ). - Điều này chứng tỏ công đoạn sấy không ảnh hưởng nhiều đến sức sống của bào tử. - Kết quả thí nghiệm là rất phù hợp với báo cáo của Thanh và Nout (2002) khi sấy bào tử Rhizopus oligosporus ở 42°C, 48 giờ bào tử sống vẫn duy trì ở mức cao nhất. - Do đó nghiệm thức 2 sấy bào tử Actinomucor elegans ở 42°C, 48 giờ được chọn cho các thí nghiệm sau.. - 3.3 Ảnh hưởng của xay mẫu đến số lượng bào tử sống của Actinomucor elegans. - Bảng 3: Số lượng tế bào tử sống, chết, và miên trạng sau khi xay mẫu Nghiệm. - Log 10 bào tử/g ) 0 Sau khi sấy. - Điều này càng chứng tỏ phương pháp huỳnh quang chính xác hơn cho trường hợp định lượng bào tử sống trong mẫu giống mốc bột bào tử (Võ Thị Nguyệt Thủy, 2007. - Kết quả chỉ ra trong 3 nghiệm thức (NT) xay 1, 2 và 3 phút, NT 1 xay 1 phút có số lượng bào tử sống cao nhất 84,62% khác biệt có ý nghĩa với các NT còn lại (65,28% và 21,68. - Ngược lại, số lượng bào tử chết và miên trạng ở NT 1 là thấp nhất (10,25% và 5,13%) và càng tăng lên theo thời gian xay mẫu ở NT 2 và 3. - Điều này càng chứng minh NT 1 (xay 1 phút) là tốt nhất và ít tổn thương nhất đến sức sống bào tử. - 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và dụng cụ bảo quản đến số lượng bào tử sống (Log10 N/g) theo thời gian tồn trữ. - Bảng 4: Số lượng bào tử sống duy trì trong thời gian tồn trữ NT. - Sản lương bào tử Log 10 bào tử/g = 10,33. - số lượng bào tử sống sau sấy (chưa xay) là 91,03%. - số lượng bào tử sống sau xay là 90,77%.. - Kết quả này là khác với kết quả của Thanh và Nout (2002) khi nghiên cứu trên bào tử của Rhizopus oligosporus, khả năng sống của bào tử đã giảm đi nhiều sau 1 tháng bảo quản ở 25 o C cũng như 5 o C và tiếp tục giảm ít đi sau đó. - Bào tử duy trì sức sống cao trong điều kiện trữ trong tủ lạnh (4°C). - Điều này chứng tỏ nhiệt độ 4°C (tủ lạnh) là tốt nhất cho trữ giống mốc bột bào tử. - Kết quả này là phù hợp với nghiên cứu bảo quản mốc giống bột bào tử Rhizopus oligosporus (dùng sản xuất tempeh) của nhiều tác giả.. - (1992), kết quả chỉ rằng sức sống của bào tử vẫn duy trì mức cao sau 30 tuần bảo quản ở 5, 25 và 37°C nhưng tốt nhất ở 5°C. - Wang và Hesseltine (1975) công bố rằng khi trữ giống bột bào tử ở 4°C trong 6 tháng, số lượng bào tử sống giảm không đáng kể, tuy nhiên khi trữ ở nhiệt độ phòng số lượng bào tử sống giảm đi một cách khác biệt. - thức duy trì sức sống cao nhất là nghiệm thức Tủ-Túi polypropylene, lượng bào tử sống không khác biệt sau 5 tháng bảo quản (từ 90,77. - Bên cạnh đó nghiệm thức Tủ lạnh-Chai (thủy tinh), lượng bào tử sống không khác biệt sau 3 tháng bảo quản (từ 90,77. - Điều này chứng tỏ có sự khác biệt nhỏ về dụng cụ chứa mẫu, túi polypropylen là thích hợp hơn cho trữ giống mốc bột bào tử.. - Trong sản xuất giống bào tử nấm mốc Actinomucor elegans, hỗn hợp cơ chất tốt nhất là tấm và cám (2:1), mật số chủng là 10 5 bào tử/gck và thời gian ủ là 6 ngày ủ ở 30°C. - Tổ hợp nghiệm thức này sẽ đạt được sản lượng cao nhất 10 10 bào tử/gck. - Trong công đoạn xử lý để sản xuất bột bào tử nấm mốc A. - elegans, nhiệt độ sấy, thời gian sấy và thời gian xay mẫu tốt nhất để bào tử sống cao nhất là ở 42°C trong 48 giờ và xay 1 phút (bằng máy xay mẫu Bioblock).. - Sức sống của bào tử A. - Điều kiện bảo quản tốt nhất để duy trì bào tử sống cao nhất là trữ ở 4°C trong túi polypropylene ép kín miệng.. - Quy trình tối ưu sản xuất giống bột bào tử mốc Actinomucor elegans dùng sản xuất chao chất lượng cao đã được thiết lập (Hình 2).. - 10 5 bào tử/gck. - Ủ ở 30 o C, 6 ngày Thu hoạch bào tử Sấy khô 42 o C, 48giờ. - Dịch trích bào tử. - Nghiên cứu sản xuất bào tử nấm mốc Aspergillus oryzae