- DOI:10.22144/ctu.jsi.2016.033 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN XỬ LÝ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH ENZYME AMYLASE VÀ PROTEASE TỪ Aspergillus oryzae TRÊN KOJI NẤM BÀO NGƯ (Pleurotus SPP.) Nguyễn Thị Ngọc Giang và Nguyễn Minh Thủy. - Production of enzyme by Aspergillus oryzae on oyster mushroom koji as affected by treatment conditions and wheat flour supplement. - Koji for soy sauce is made from steamed oyster mushroom (Pleurotus Spp.) and wheat flour addition, with Aspergillus oryzae used as koji starter. - Enzymes produced by Aspergillus oryzae play an important role in koji stage, which is one of two steps of fermentation process. - The spores of Aspergillus oryzae (growth of mold through the formation of mycelium on koji surfaces) were formed after 30 hours of cultivation period. - Thuật ngữ koji diễn tả quá trình chuẩn bị dòng nấm mốc có thể phát triển được trên các loại nguyên liệu nấu chín. - Các enzyme được sinh ra từ nấm mốc Aspergillus oryzae đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn koji. - Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian hấp o C và phút, tương ứng) nấm bào ngư Pleurotus spp.. - cùng với tỷ lệ bột mì bổ sung đến hoạt tính enzyme amylase và protease trong giai đoạn koji. - Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính enzyme amylase và protease cao nhất (37,72 và 8,90 đv/g chất khô, tương ứng) khi hấp nấm bào ngư ở nhiệt độ 90 o C tại thời điểm mẫu vừa đạt được nhiệt độ 90 o C – 0 phút cùng với lượng bột mì bổ sung 10%. - Hơn nữa, sự tăng hoạt tính enzyme có liên quan đến sự phát triển của nấm mốc. - Sự phát triển của nấm mốc (thông qua việc hình thành sợi nấm trên bề mặt môi trường) được tìm thấy ở 30 giờ nuôi cấy. - Cũng trong thời gian này, hoạt tính enzyme amylase và protease sinh ra được tìm thấy cao nhất, tương ứng là 62,45 và 13,25 đv/g chất khô.. - Ảnh hưởng của điều kiện xử lý đến khả năng sinh enzyme amylase và protease từ Aspergillus oryzae trên koji nấm bào ngư (Pleurotus spp. - Lên men koji là bước đầu tiên trong quá trình sản xuất nước chấm lên men. - Aspergillus oryzae là chủng có khả năng biến đổi tinh bột thành đường tạo cho sản phẩm có vị ngọt. - Nấm mốc này khi mọc có màu vàng nên dân gian hay gọi là mốc hoa cau (Nguyễn Đức Lượng, 2006). - Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật (Nguyễn Thị Hiền, 2006). - Trong quá trình lên men koji, nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzyme amylase, invertase, maltoase, protease và catalase có khả năng phân giải tinh bột và protein thành đường và acid amin, tương ứng (Ward et al., 2006. - Hơn nữa, nấm mốc Aspergillus oryzae có kiểu gen đặc trưng và được xem là một sinh vật an toàn cho sản xuất thực phẩm vì không sản sinh độc tố aflatoxin (Machida et al., 2005).. - Trong lên men truyền thống, lên men cơ chất rắn (SSF) là thích hợp cho nấm mốc phát triển bởi độ ẩm thấp và cho phép các khuẩn ty của nấm xâm nhập vào cơ chất (Chancharoonpong et al., 2012).. - Thời gian và nhiệt độ khi nấu nguyên liệu có ảnh hưởng đến màu sắc và vị của nước tương thành phẩm, thời gian nấu càng dài nước tương có màu càng sậm (Nguyễn Thị Hiền, 2006).. - Vì vậy, khi hấp cần chú ý đến nhiệt độ hấp, thời gian hấp để nguyên liệu có hàm lượng nước thích hợp và mềm hóa đầy đủ. - Nếu hấp với thời gian quá lâu và nhiệt độ quá cao thì protein trở thành chất mà enzyme không phân giải được và làm cho các acid amin bị phân hủy. - Lựa chọn tỷ lệ bột mì bổ sung sẽ ảnh hưởng đến hàm lượng các chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy (nguồn C, nguồn N, chất cảm ứng, chất khoáng) và ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme được tạo ra bởi nấm mốc. - Bột mì được phối trộn sẽ là nguồn tinh bột mà mốc sử dụng làm nguồn thức ăn để sinh trưởng và phát triển mạnh. - Hoạt tính enzyme là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá khả năng sinh enzyme của nấm mốc Aspergillus oryzae trên các môi trường có các độ ẩm khác nhau. - Mục tiêu của nghiên cứu là xác lập được nhiệt độ và thời gian hấp nấm cùng với tỷ lệ bột mì bổ sung phù hợp cho môi trường nuôi cấy Aspergillus oryzae, nhằm sản sinh enzyme protease và amylase có hoạt tính cao nhất ứng dụng trong sản xuất nước chấm lên men.. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Chuẩn bị nguyên liệu cho quá trình lên men koji. - Bột mì đa dụng Meizan được rang vàng ở 80 o C trong 15 phút. - Nấm mốc Aspergillus oryzae (0,02%/nấm bào ngư) được sử dụng (nguồn này được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ).. - Thí nghiệm được bố trí với 3 nhân tố và lặp lại 3 lần, bao gồm (i) Nhiệt độ hấp o C. - (ii) thời gian hấp phút và (iii) hàm lượng bột mì . - 200 g nấm bào ngư hấp ở các nhiệt độ 80, 90 và 100 o C ở các mức thời gian 0, 2, 4 và 6 phút. - Bột mì rang vàng và được phối trộn vào nấm bào ngư đã hấp. - amylase được xác định theo thời gian nuôi. - Hoạt tính enzyme amylase (đv/g), hoạt tính enzyme protease (đv/g) và hàm ẩm. - Một đơn vị hoạt độ amylase được biểu diễn bằng lượng men có khả năng xúc tác thủy phân 1 g tinh bột trong 1 giờ ở điều kiện nhiệt độ 30 o C và pH . - Đơn vị hoạt độ protease là lượng enzyme chuyển hóa được một lượng caseinat natri thành dạng không bị kết tủa bởi acid tricloacetic tương đương với 1 µmol tyrosin ở 30 o C trong thời gian 1 phút. - 2.5.3 Xác định độ ẩm (TCVN Thực hiện bằng phương pháp sấy mẫu ở nhiệt độ 105 o C đến khối lượng không đổi, độ ẩm W. - 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ hấp, thời gian hấp nấm bào ngư và hàm lượng bột mì bổ sung đến khả năng sinh enzyme (amylase và. - protease) của nấm mốc Aspergillus oryzae So sánh khả năng sinh enzyme của nấm mốc Aspergillus oryzae trên các môi trường có các độ. - ẩm khác nhau có thể dựa vào hoạt tính enzyme amylase và protease của các mẫu nấm bào ngư được xử lý ở các mức độ khác nhau về nhiệt độ hấp, thời gian hấp và tỷ lệ bột mì bổ sung. - Hàm ẩm của khối nguyên liệu, hoạt tính enzyme amylase và protease sinh ra trong quá trình lên men koji được cho ở Bảng 1.. - Kết quả thu nhận được cho thấy trong cùng nhiệt độ hấp và thời gian hấp nấm bào ngư, khi tăng tỷ lệ bột mì thì hàm ẩm của khối nguyên liệu giảm và thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa (mức ý nghĩa 5. - Mặt khác, hoạt tính amylase sinh ra tăng cao khi hàm lượng bột mì bổ sung 10 và 20%. - Do đó, tỷ lệ bột mì bổ sung 10% được xem là phù hợp. - Kết quả này cũng phù hợp với tài liệu của Nguyễn Thị Hiền (2006) là phối trộn 10% bột mì vào 90% khô đậu và cho thêm 60 – 75% nước so với khối lượng trên.. - Độ ẩm là yếu tố quan trọng trong quá trình nuôi cấy nấm mốc để thu nhận enzyme. - Kết quả phân tích thể hiện đồng thời ở Bảng 1 cho thấy, hàm ẩm của khối nguyên liệu giảm khi tăng nhiệt độ hấp và khác biệt ở mức ý nghĩa 5% giữa các mẫu hấp ở 80 o C so với mẫu hấp 90 và 100 o C.. - Đồng thời, khi thời gian hấp là 4 phút thì hàm ẩm là thấp nhất và khác biệt ở ý nghĩa 5% so với các thời gian hấp còn lại. - Kết quả thu nhận cho thấy, hoạt tính enzyme amylase sinh ra trong quá trình nuôi mốc cao nhất ở thời điểm nấm hấp vừa đạt nhiệt độ 90 o C (0 phút). - Hoạt tính enzyme protease sinh ra cao nhất ở nhiệt độ hấp 90 o C và khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% khi thời gian hấp là 0 phút (vừa đạt nhiệt độ cần thiết được bố trí) và hấp 4 phút.. - Vì vậy, thí nghiệm tiếp theo được thực hiện với các khoảng nhiệt độ 50 đến 100 o C (cách nhau 10 o C) khi mẫu vừa đạt được nhiệt độ thí nghiệm với tỷ lệ bột mì bổ sung là 10%. - Hoạt tính enzyme là chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá khả năng sinh enzyme của nấm mốc trên các môi trường có độ ẩm khác nhau. - Kết quả phân tích cho thấy, hoạt tính enzyme sinh ra (amylase và protease) khi mẫu vừa đạt nhiệt độ hấp là 90 o C là cao nhất. - nguyên liệu được xử lý ở điều kiện hấp nấm khi mẫu vừa đạt nhiệt độ 90 o C (ký hiệu là 0 phút), tỷ lệ bột mì bổ sung 10% là môi trường thích hợp cho nấm mốc Aspergillus oryzae phát triển sinh enzyme (amylase và protease) với hoạt tính cao nhất.. - Bảng 1: Hàm ẩm của khối nguyên liệu, hoạt tính enzyme amylase và protease sinh ra theo tổ hợp các nhân tố (nhiệt độ hấp, thời gian hấp và tỷ lệ bột mì bổ sung)*. - Nhiệt độ hấp ( o C). - Thời gian hấp (phút). - Bột mì. - Hoạt tính enzyme (đv/g chất khô). - Bảng 2: Thay đổi hoạt tính enzyme amylase và protease sinh ra khi thay đổi nhiệt độ hấp (50 – 100 o C) ở thời điểm mẫu vừa đạt nhiệt độ thí nghiệm, bột mì bổ sung 10%. - Mẫu Nhiệt độ hấp ( o C). - Hoạt tính enzyme (đv/g chất khô) Amylase Protease. - 3.2 Thay đổi hàm ẩm, hoạt tính enzyme amylase và protease theo thời gian lên men koji. - Để tìm hiểu rõ hơn về quá trình lên men koji, nghiên cứu sẽ theo dõi sự thay đổi hàm ẩm của khối môi trường, hoạt tính enzyme (amylase và protease) sinh ra theo thời gian lên men koji ở điều kiện xử lý nguyên liệu là hấp nấm ở thời điểm mẫu vừa đạt nhiệt độ 90 o C và tỷ lệ bột mì bổ sung là 10%. - Quá trình nuôi mốc (hay còn gọi là quá trình lên men koji) nhằm thu nhận chất lượng và số lượng enzyme cao (Nguyễn Thị Hiền, 2006). - Kết quả thể hiện ở Hình 1 cho thấy hàm ẩm của khối môi trường giảm dần theo thời gian nuôi mốc.. - Trong khi đó, dữ liệu được trình bày ở Hình 2 và 3 lại cho thấy hoạt tính enzyme amylase và protease sinh ra tăng nhanh chóng và đạt cao nhất ở thời điểm 30 giờ của quá trình nuôi mốc. - Sau đó, hoạt tính enzyme giảm dần. - Hoạt tính enzyme amylase sinh ra cao nhất là 62,45 đv/g, của enzyme protease là 13,25 đv/g, tương ứng với hàm ẩm khối nguyên liệu là 68,26%. - Kết quả này cũng phù hợp với tài liệu của Ngạc Văn Dậu (1983), Lê Ngọc Tú (2002), Nguyễn Đức Lượng (2004), Nguyễn Thị Hiền (2006) là độ ẩm thích hợp để nấm mốc Aspergillus oryzae hình thành enzyme là 60 – 68%. - và thời gian sinh enzyme cao từ 30 – 42 giờ. - Do đó, thời gian nuôi mốc được xác định là 30 giờ để nấm mốc Aspergillus oryzae sinh enzyme (amylase và protease) có hoạt tính cao.. - 3.3 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Aspergillus oryzae trong quá trình lên men koji. - Sự gia tăng hoạt tính enzyme cũng liên quan đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Aspergillus oryzae (Chancharoonpong et al., 2012). - Sự sinh trưởng của nấm mốc Aspergillus oryzae ở các tỷ lệ bổ sung bột mì khác nhau được thể hiện ở Hình 4, Hình 5 và Hình 6.. - Hình 4: Sự phát triển của mốc Aspergillus oryzae theo thời gian nuôi mốc ở mẫu đối chứng (không bổ sung bột mì). - Những đốm trắng xuất hiện nhiều hơn ở những giờ nuôi cấy tiếp theo và sự bung tơ của nấm mốc rất. - nấm bắt đầu mọc ở 24 giờ nuôi cấy và ở 30 giờ thì sợi nấm lan ra rộng trong khối môi trường có bổ sung 10 và 20% bột mì. - Bào tử nấm mốc chuyển màu vàng hoa cau bắt đầu ở 48 giờ nuôi cấy. - Kết quả này cho thấy rằng, sự hình thành sợi nấm và bào tử có liên quan đến sự sinh enzyme của nấm mốc và liên quan đến tỷ lệ bột mì bổ sung. - Mặt khác, kết quả thống kê ở Bảng 1 cho thấy hoạt tính enzyme sinh ra cao ở tỷ lệ bột mì bổ sung 10%. - Sự hình thành sợi nấm, bào tử và hoạt tính enzyme cao đều được tìm thấy ở 30 – 48 giờ nuôi cấy. - Bên cạnh đó, sự phát triển của nấm mốc cũng cho thấy mối quan hệ tương phản với độ ẩm.. - Nấm mốc Aspergillus oryzae sử dụng nước trên bề mặt khối môi trường để sinh trưởng và tạo ra sợi nấm, hình thành bảo tử (Lương Đức Phẩm, 2010).. - Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt tính enzyme. - Sự tạo enzyme cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử (Nguyễn Đức Lượng, 2004). - Như vậy, sự phát triển của nấm mốc (thông qua việc hình thành sợi nấm trên bề mặt môi trường) trên môi trường bổ sung tinh bột 10% và enzyme sinh ra có hoạt tính cao nhất được tìm thấy ở thời điểm 30 giờ của quá trình nuôi cấy.. - Hình 5: Sự phát triển của mốc Aspergillus oryzae theo thời gian nuôi mốc với lượng bột mì bổ sung 10%. - Hình 6: Sự phát triển của mốc Aspergillus oryzae theo thời gian nuôi mốc với lượng bột mì bổ sung 20%. - Kết hợp điều kiện xử lý nấm bào ngư với hàm lượng bột mì bổ sung nhằm xác định được môi trường thích hợp để nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sinh trưởng và phát triển sinh enzyme amylase và protease có hoạt tính cao. - Production of enzyme and growth of Aspergillus oryzae S . - Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men.. - Giáo trình công nghệ lên men. - Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae. - Growth and enzyme production insolid-state culture of Aspergillus oryzae. - Thực phẩm lên men truyền thống. - Aspergillus oryzae insolid-state and submerged fermentations progress report onamulti- disciplinary Project