- Nguyễn Đàm Lý. - BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYM DEHALOGENASE TỪ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP. - Hợp chất halogen. - Tình hình sử dụng hợp chất có chứa clo ở Việt Nam. - Quá trình phân hủy trong môi trƣờng tự nhiên của 2,2 DCPS. - Hóa chất và môi trƣờng nuôi cấy. - Phƣơng pháp nghiên cứu. - Nguyễn Đàm Lý Khóa 2011-2013. - Nghiên cứu các đặc điểm hóa sinh của các chủng vi sinh vật. - Nghiên cứu các điều kiện sinh trƣởng và khả năng sử dụng một số cơ chất khác nhau. - Đánh giá khả năng phân hủy hợp chất 2,2 DCPS. - Phƣơng pháp nghiên cứu tinh sạch dehalogenase. - Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng 2,2 DCPS. - Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ khác nhau của chủng H11. - Nghiên cứu khả năng sinh trƣởng phát triển chủng H11. - 3.5.Khả năng phân hủy 2,2 DCPS. - 3.5.2.Khả năng phân hủy 2,2 DCPS theo thời gian. - Sự luân chuyển thuốc BVTV trong môi trƣờng không khí và nƣớc. - Hình thái một số chủng vi sinh vật trên môi trƣờng thạch MGB. - Chủng vi khuẩn H11 trên môi trƣờng MGB và MGB bổ sung Bromothymol blue. - Khả năng sinh trƣởng của chủng H11 trên môi trƣờng MGB và MGB 0.1% cao nấm. - Khả năng sinh trƣởng của chủng H11 tại các nhiệt độ khác nhau trên môi trƣờng MGB. - Khả năng sinh trƣởng của H11 với các nồng độ cơ chất khác nhau trên môi trƣờng MGB. - Khả năng phân hủy theo thời gian của H11 trên môi trƣờng MGB 39 Hình 15. - Sử dụng của hợp chất clo ở châu Âu năm 2012. - Đặc điểm các khuẩn lạc trên môi trƣờng MGB có bổ sung cơ chất 2,2 DCPS. - Phƣơng pháp sinh học sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất halogen đƣợc đánh giá là hƣớng nghiên cứu mới có tiềm năng cao không chỉ cho hiệu quả cao mà còn thân thiện với môi trƣờng, ít tốn kém và mang tính bền vững. - Trong tự nhiên tồn tại một số nhóm vi sinh vật có khả năng sử dụng các hợp chất halogen làm nguồn cung cấp cacbon duy trì hoạt động sống, chúng chuyên hóa các hợp chất halogen từ dạng độc hại trở thành dạng ít hoặc không độc với môi trƣờng sinh thái và con ngƣời.. - Hợp chất clo hữu cơ đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống nhƣ các sản phẩm nhựa, các dung môi tẩy rửa. - Một số loại thuốc nhuộm đƣợc sử dụng để nhuộm len, cellulose, bông và sợi tổng hợp. - Clorua benzyl đƣợc sử dụng để tổng hợp các loại thuốc phenobarbital, benzedrine, và demerol. - và đƣợc sử dụng cho tạo hình động mạch vành [38].. - Hơn 1000 loại thuốc bảo vệ thực vật đã đƣợc sử dụng trong nông nghiệp bao gồm:. - Hợp chất hữu cơ chứa clo cũng đƣợc sử dụng nhƣ là nguyên liệu cơ bản để sản xuất của một số thuốc trừ sâu. - Ở các nƣớc càng phát triển thì lƣợng các hợp chất clo đƣợc sản xuất và sử dụng càng nhiều. - Chỉ riêng ở châu Âu năm 2012 đã sử dụng đến gần 10 triệu tấn hợp chất có chứa clo (bảng 1).. - Nguyễn Đàm Lý 5 Khóa 2011-2013 Bảng 1.Sử dụng của hợp chất clo ở châu Âu năm triệu tấn) [54]. - Việc sử dụng thuốc BVTV trong nông nghiệp đã làm tác động tới môi trƣờng sinh thái. - Sự luân chuyển thuốc BVTV trong môi trƣờng không khí và nƣớc[13]. - Nguyễn Đàm Lý 7 Khóa . - 2 2,2-DCPS 0,1. - Nguyễn Đàm Lý 9 Khóa . - Khí thải khi xử lý an toàn cho môi trƣờng. - khí thải rất an toàn cho môi trƣờng (khi có hệ thống lọc khí thải). - Trong những năm gần đây xu hƣớng sử dụng vi sinh vật để phân huỷ lƣợng tồn dƣ thuốc BVTV một cách an toàn đƣợc chú trọng nghiên cứu [60].. - Biện pháp phân huỷ thuốc BVTV bằng tác nhân sinh học dựa trên cơ sở sử dụng nhóm vi sinh vật có sẵn môi trƣờng đất, các sinh vật có khả năng phá huỷ sự phức tạp trong cấu trúc hoá học và hoạt tính sinh học của thuốc BVTV. - Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng trong môi trƣờng đất quần thể vi sinh vật trong môi trƣờng đất luôn luôn có khả năng thích nghi đối với sự thay đổi điều kiện sống. - Quá trình phân hủy thuốc BVTV của sinh vật đất đã xẩy ra trong môi trƣờng có hiệu suất chuyển hoá thấp. - Hiện nay, sự phân hủy 2,2 DCPS trong môi trƣờng đất chủ yếu là nhờ vi sinh vật. - Một số chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng 2,2 DCPS làm nguồn cung cấp carbon cho quá trình trao đổi chất của chúng. - Các nghiên cứu đều cho thấy trong điều kiện nuôi cấy và làm giàu trên môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung cơ chất 2,2 DCPS các chủng vi sinh vật có thể sinh trƣởng và sản sinh ra dehalogenase.. - Ở Việt Nam, hiện nay chƣa có nhiều nghiên cứu về phân hủy hợp chất 2,2 DCPS bằng con đƣờng sinh học sử dụng các vi sinh vật, phần lớn các nghiên cứu chỉ tập trung vào các hợp chất trong thuốc trừ sâu nhƣ DDT, hay Dioxin [6,9,1].. - Nguyễn Đàm Lý 15 Khóa 2011-2013 việc giải quyết ô nhiễm hay tồn dƣ thuốc trừ cỏ 2,2 DCPS trong môi trƣờng đất, nƣớc, không khí ở Việt Nam.. - Hiện nay cách thức để thu nhận enzym dehalogen chủ yếu là nuôi cấy các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung cơ chất là dẫn xuất halogen làm nguồn cung cấp carbon. - Nguyễn Đàm Lý 17 Khóa 2011-2013 Chƣơng 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - Nguyễn Đàm Lý 18 Khóa 2011-2013. - Các hóa chất khác trong sử dụng đều có độ tinh sạch cao đảm bảo cho các nghiên cứu phân tích.. - Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu gồm: Nồi khử trùng (ALP - Nhật Bản). - Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. - Các mẫu nghiên cứu đƣợc nuôi cấy làm giàu 2 lần, 5 ngày/1 lần trên môi trƣờng MGB có chứa 20mM 2,2 DCPS. - Môi trƣờng thạch MGB đƣợc bổ sung Bromothymol lue (75mg/l). - Vi khuẩn Gram. - Nguyễn Đàm Lý 21 Khóa 2011-2013. - Các chủng vi khuẩn đƣợc nuôi lắc ở 30 o C, 160rpm trên môi trƣờng MGB, cơ chất 2,2 DCPS đƣợc thêm với nồng độ cuối cùng là 20mM. - Nhiệt độ là một trong những yếu tố của môi trƣờng tác động trực tiếp đến sự sinh trƣởng, phát triển của vi sinh vật. - Tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ, chủng vi khuẩn đƣợc nuôi ở các nhiệt độ C trên môi trƣờng MGB, cơ chất 2,2 DCPS đƣợc thêm với nồng độ cuối cùng là 20mM. - Nồng độ cơ chất trong môi trƣờng có ảnh hƣởng quan trọng đến sự sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi sinh vật, nồng độ quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế khả năng sinh trƣởng của loài. - Khi vi sinh vật sử dụng cơ chất sinh trƣởng phát triển thì dehalogenase của vi sinh vật sẽ cắt đứt liên kết C-Cl giải phóng clo dƣới dạng. - Đánh giá khả năng phân hủy cơ chất:. - Vi khuẩn đƣợc nuôi trong môi trƣờng MGB có chứa 25mM cơ chất 2,2 DCPS. - Nguyễn Đàm Lý 25 Khóa 2011-2013. - Sau thời gian từ 3 đến 5 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng MGB có bổ sung cơ chất 2,2 DCPS chúng tôi đã thu đƣợc kết quả nhƣ trình bày ở bảng 5. - Kết quả nghiên cứu cho thấy không phân lập đƣợc chủng vi nấm nào mọc trên môi trƣờng chọn lọc. - Trong nhiều nghiên cứu việc phân lập vi khuẩn sử dụng trong phân giải hợp chất halogen đƣợc đề cập trong nhiều nghiên cứu [5].. - Đặc điểm các khuẩn lạc trên môi trƣờng MGB có bổ sung cơ chất 2,2 DCPS Kí hiệu Đƣờng. - Kết quả nghiên cứu trên bảng 5 cho thấy trên môi trƣờng nuôi cấy có khoáng cơ bản và bổ sung hợp chất 2,2 DCPS phân lập đƣợc 20 chủng vi khuẩn. - Số lƣợng các chủng vi khuẩn phân lập chƣa cao cũng có thể nguyên nhân do 2,2 DCPS là một chất độc và môi trƣờng khoáng cơ bản không có quá nhiều chất dinh dƣỡng. - Chủng vi khuẩn H11 trên môi trƣờng MGB (A) và MGB bổ sung Bromothymol blue (B).. - Ngoài ra chúng còn đƣợc sử dụng trong xử lý nƣớc thải trong phƣơng pháp bùn hoạt tính [39,55].. - Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ khác nhau của chủng H11 Để nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng phân lập, chúng tôi sử dụng kit thử API 20NE là kit chuyên dụng đối với vi khuẩn Gram âm của hãng Biomeriux. - Kết quả thử kit API 20NE của chủng H11 Khả năng sử dụng các. - loại hợp chất hữu. - Chủng H11. - Khả năng sử dụng các loại hợp chất hữu. - Với khả năng sử dụng các loại đƣờng khác nhau, chủng vi khuẩn H11 này có thể sinh trƣởng mạnh hơn trên môi trƣờng có bổ sung thêm 2,2 DCPS là một hợp chất độc và khó bị. - Nguyễn Đàm Lý 37 Khóa 2011-2013. - Khả năng sinh trưởng (OD 600nm). - Chủng H11 cũng có khả năng sử dụng một số hợp chất nhƣ gelatin hay chuyển hóa các axit giúp cho quá trình sinh trƣởng.. - Khả năng sinh trƣởng của chủng H11 trên môi trƣờng MGB và MGB 0.1% cao nấm.. - Trong môi trƣờng MGB sau 1 ngày nuôi cấy chúng tôi nhận thấy dải nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trƣởng của chủng H11 là 25 đến 37 o C.. - Đây là khoảng nhiệt độ phù hợp với môi trƣờng phân lập cũng nhƣ các kết quả nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật ở Việt Nam trƣớc đây trong điều kiện phân hủy các hợp chất độc hại [10,4].. - Nguyễn Đàm Lý 38 Khóa 2011-2013. - Khả năng sinh trƣởng của chủng H11 tại các nhiệt độ khác nhau trên môi trƣờng MGB.. - Dải nồng độ cơ chất đƣợc sử dụng là từ 5 đến 40mM [25]. - Đánh giá khả năng phân hủy hợp chất 2,2 DCPS theo thời gian là giờ trên môi trƣờng MGB của chủng H11 chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:. - Khả năng phân hủy theo thời gian của H11 trên môi trƣờng MGB Sau 24 giờ tiến hành nuôi cấy chủng H11 trên môi trƣờng MGB chứa 25mM 2,2 DCPS. - Để xác định kích thƣớc và tinh sạch dehalogenase có trong chủng H11 chúng tôi tiến hành kỹ thuật sắc ký trao đổi anion sử dụng gel Q sepharose.. - Phân lập đƣợc 20 chủng vi sinh vật trên môi trƣờng có bổ sung 2,2 DCPS là nguồn cacbon, các khuẩn lạc chủ yếu có hình tròn, kích thƣớc khoảng từ 0,5-5mm. - Alcaligenes faecalis_H11 có khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất khác nhau các loại đƣờng đơn nhƣ Glucose, Arabinose,.... - Sau 24 giờ tiến hành nuôi cấy chủng Alcaligenes faecalis_H11 trên môi trƣờng MGB chứa 25mM 2,2 DCPS