- CHỌN LỌC MÔ SẸO ĐẬU NÀNH MTĐ 760-4 CHỐNG CHỊU MẶN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY in vitro. - Đậu nành MTĐ 760-4, chống chịu mặn, in vitro, NaCl, mô sẹo, proline Keywords:. - Kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bào mô sẹo trên môi trường có chứa tác nhân chọn lọc là muối NaCl có thể giúp tạo nên các giống cây trồng chống chịu mặn. - Mô sẹo giống đậu nành MTĐ 760-4 được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung muối NaCl với các nồng độ 0. - Mô sẹo sống sót trên môi trường mặn được cấy chuyền trên cùng môi trường trong 4 chu kỳ với mỗi chu kỳ là 5 tuần. - Kết quả đã chọn lọc được các mẫu mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 có thể chống chịu mặn đến nồng độ muối NaCl 5 g/L với tỷ lệ sống trên 90% và khả năng chịu mặn khá ổn định sau 4 lần chọn lọc.. - Hàm lượng proline tích lũy cao trong mô sẹo ở nồng độ muối 5 g/L.. - Chọn lọc mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 chống chịu mặn bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. - Đậu nành (Glycine max (L.) Merrill) là cây thực phẩm và cũng là cây công nghiệp có giá trị kinh tế rất cao không chỉ được trồng làm thức ăn cho người và gia súc mà còn là một trong những cây màu luân canh cải tạo đất rất tốt. - Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là một trong những vùng trồng đậu nành lớn của cả nước. - Tuy nhiên, trong những năm gần đây tình trạng nhiễm mặn ở ĐBSCL ngày càng nghiêm trọng làm ảnh hưởng đến tình hình sản xuất của nhiều loại cây trồng nói chung và đậu nành nói riêng. - hưởng đến các đặc tính nông học của cây đậu nành từ đó ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng hạt, vì vậy cần có biện pháp để chọn tạo các dòng đậu nành có khả năng thích nghi với môi trường đất bị nhiễm mặn, giúp mở rộng diện tích cây trồng này ở ĐBSCL. - Trong đó, kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bào, mô hay cơ quan thực vật trên môi trường có chứa tác nhân chọn lọc là muối NaCl có thể giúp chọn lọc được các dòng cây trồng chống chịu mặn.. - Patade et al., 2005)… Vì vậy, nghiên cứu được thực hiện nhằm chọn lọc các dòng chống chịu mặn của giống đậu nành MTĐ 760-4, phục vụ cho công tác tạo giống mới thích nghi với điều kiện xâm nhập mặn ở ĐBSCL.. - Hạt đậu nành giống MTĐ 760-4 là giống có nguồn gốc từ dòng lai MTĐ 176 x A70 Đại học Cần Thơ, do Bộ môn Di truyền giống nông nghiệp, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ cung cấp.. - Hạt đậu nành MTĐ 760-4 được ngâm trong dung dịch sodium hypochloride (NaOCl) 10%. - Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của muối NaCl đến sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760- 4 trong lần chọn lọc 1. - Mô sẹo 4 tuần tuổi được cảm ứng từ tử diệp trên môi trường MS bổ sung 2,4-D 5 mg/L trong mô tả bên trên được sử dụng làm vật liệu thí nghiệm. - Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố gồm 5 nghiệm thức là muối NaCl 0;. - Mỗi nghiệm thức lặp lại 10 lần, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy 5 mẫu mô sẹo.. - Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của muối NaCl đến sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760- 4 trong lần chọn lọc 2. - Thı́ nghiê ̣m 3: Ảnh hưởng của muối NaCl đến sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760- 4 trong lần chọn lọc 3. - Thı́ nghiê ̣m 4: Ảnh hưởng của muối NaCl đến sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760- 4 trong lần chọn lọc 4. - Thí nghiệm 2, 3 và 4 được tiến hành tương tự thí nghiệm 1, với vật liệu là mô sẹo còn sống của thí nghiệm trước đó (mô sẹo có màu vàng sáng, có sự gia tăng kích thước, được 5 tuần tuổi). - Mô sẹo này được nuôi cấy trên môi trường có cùng nồng độ muối NaCl để tiếp tục đánh giá khả năng sống của mô sẹo.. - của mô sẹo: Tổng số mô sẹo còn sống/tổng số mẫu cấy.. - Đường kính mô sẹo gia tăng (cm): Được tính bằng giá trị sau – giá trị đầu. - Hàm lượng proline trong mô sẹo ( mol/g. - Các số liệu là tỷ lệ phần trăm biến động từ 0 - 100% được chuyển đổi sang dạng Arcsin√x (Gomez và Gomez, 1984).. - 3.1 Ảnh hưởng của muối NaCl đến sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 1. - Kết quả Bảng 1 cho thấy, ở thời điểm 1 tuần sau khi cấy (SKC), tỷ lệ sống của mô sẹo giảm còn 92% ở nồng độ muối 10 g/L, khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. - Từ 2 đến 5 tuần SKC, tỷ lệ sống của mô sẹo tiếp tục giảm mạnh. - Ở nghiệm thức muối NaCl 2,5 g/L, mô sẹo vẫn sống 100%. - như đối chứng, trong khi tăng nồng độ muối lên đến 5 g/L thì tỷ lệ sống giảm có ý nghĩa. - Tỷ lệ sống của mô sẹo giảm dần khi nồng độ muối tăng dần. - Ở 5 tuần SKC, tỷ lệ mô sẹo sống ở 5 g/L giảm còn 62%, và giảm mạnh đến 26% ở nồng độ muối 10 g/L. - Mặc dù mô sẹo sống sót được ở nồng độ 10 g/L nhưng tỷ lệ rất thấp (26%) và sức sống của mô sẹo kém (màu hơi nâu) nên mẫu mô sẹo ở nồng độ này không thể tiếp tục dùng để chọn lọc ở lần 2. - Ở nồng độ muối 5 và 7,5 g/L thì tỷ lệ sống của mô sẹo cao hơn (tương ứng là 62 và 44%) và cấu trúc cũng như màu sắc mô sẹo bình thường (Hình 1).. - Bảng 2 cho thấy, từ tuần 1 đến tuần 5, đường kính của mô sẹo ở các nghiệm thức đều có sự gia tăng. - Ở nghiệm thức đối chứng, đường kính mô sẹo gia tăng nhiều nhất, từ 0,13 ở 1 tuần SKC đến 0,75 cm ở 5 tuần SKC. - Mô sẹo gia tăng đường kính ít khi tăng nồng độ muối từ 2,5 đến 10 g/L. - Cụ thể ở 5 tuần SKC, đường kính của mô sẹo có khuynh hướng ít gia tăng khi tăng dần nồng độ muối.. - Đường kính gia tăng thấp nhất là ở nồng độ muối 10 g/L, chỉ đạt 0,11 cm (so với đối chứng là 0,75 cm), kế đến là nồng độ muối 7,5 và 5 g/L.. - Bảng 1: Ảnh hưởng của muối NaCl trên tỷ lệ sống. - của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 từ 1 đến 5 tuần sau khi cấy trong lần chọn lọc 1. - Nồng độ NaCl (g/L) Thời gian theo dõi. - Bảng 2: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự gia tăng đường kính (cm) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 từ 1 đến 5 tuần sau khi cấy trong lần chọn lọc 1. - Hình 1: Sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ trên môi trường MS bổ sung muối NaCl sau 5 tuần nuôi cấy trong lần chọn lọc 1 - (A) 0 g/L. - (D) 7,5 g/L và (E) 10 g/L Nhìn chung sau 5 tuần nuôi cấy, muối NaCl có. - ảnh hưởng đến sự phát triển của mô sẹo MTĐ 760- 4, cụ thể sự gia tăng đường kính mô sẹo giảm khi môi trường có nồng độ muối tăng. - Theo Kowles (2010), khi môi trường bên ngoài tế bào có nồng độ chất tan cao hơn nồng độ chất tan trong tế bào sẽ làm cho nước trong tế bào di chuyển ra ngoài, dẫn đến tế bào bị co lại.. - Như vậy, lần xử lý thứ nhất đã chọn lọc được các mẫu mô sẹo MTĐ 760-4 có khả năng chịu mặn đến nồng độ muối NaCl 7,5 g/L. - Mô sẹo ở nồng độ muối 10 g/L có tỷ lệ sống và sự gia tăng đường kính quá thấp, sức sống kém (màu hơi nâu) nên không thể tiếp tục chọn lọc ở lần 2.. - 3.2 Ảnh hưởng của muối NaCl đến sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 2. - Nồng độ muối cao 5 và 7,5 g/L vẫn tiếp tục có ảnh hưởng đến khả năng sống của mô sẹo. - Tỷ lệ sống của các mẫu mô sẹo này có khuynh hướng giảm dần theo thời gian đến 5 tuần SKC và thấp dần khi tăng nồng độ muối. - Cụ thể, mô sẹo có tỷ lệ sống thấp nhất ở nghiệm thức muối 7,5 g/L ở tuần 1 là 67,5%. - Nghiệm thức muối 5 g/L có tỷ lệ sống cũng cao khá cao là 76%. - Mô sẹo có sự sinh trưởng (gia tăng đường kính) theo thời gian đến 5 tuần SKC ở cả nghiệm thức đối chứng và xử lý muối. - Tuy nhiên, sự gia tăng đường kính của mô sẹo trong lần chọn lọc 2 này cũng tuân theo quy luật là do bị ảnh hưởng bởi mặn nên sự sinh trưởng của mô sẹo bị kìm hãm. - Mô sẹo mặc dù sống sót trên môi trường mặn đến nồng độ 7,5 g/L (17,5. - tuy nhiên đường kính mô sẹo gia. - Bảng 3: Ảnh hưởng của muối NaCl lên tỷ lệ sống. - của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 từ 1 đến 5 tuần sau khi cấy trong lần chọn lọc 2. - Bảng 4: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự gia tăng đường kính (cm) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 từ 1 đến 5 tuần sau khi cấy trong lần chọn lọc 2. - Nồng độ NaCl (g/L) Thời gian theo dõi (tuần). - Kết quả xử lý lần 2 cho thấy đã chọn lọc được các dòng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 có khả năng chịu mặn đến nồng độ 5 g/L, với tỷ lệ sống đạt 76%. - Mô sẹo ở nghiệm thức NaCl 7,5 g/L có tỷ lệ sống quá thấp (17,5%) và phát triển chậm nên không thể tiếp tục chọn lọc ở lần chọn lọc tiếp theo.. - 3.3 Ảnh hưởng của muối NaCl đến sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 3. - Trong lần chọn lọc 3, mẫu mô sẹo ở các nồng độ muối NaCl từ 0-5 g/L tiếp tục được nuôi cấy trên cùng môi trường mặn. - Kết quả Bảng 5 cho thấy, khi xử lý muối đến lần 3 thì tỷ lệ sống của mô. - Cụ thể đến 4 tuần SKC, tỷ lệ sống của mô sẹo ở nghiệm thức muối 5g/L là 96%, không khác biệt so với đối chứng. - Đến 5 tuần SKC thì tỷ lệ này có sự giảm nhẹ còn 94%.. - Mô sẹo sống sót cao ở nghiệm thức muối 5 g/L nhưng sự gia tăng đường kính không nhiều khi nuôi cấy đến 5 tuần. - Sự chậm sinh trưởng do ảnh hưởng bởi mặn vẫn còn. - Ở nồng độ muối 2,5 g/L, mô sẹo gần như sinh trưởng bình thường như đối chứng nhưng sinh khối của mô sẹo cũng có phần giảm do ảnh hưởng bởi mặn. - Sự gia tăng đường kính của mô sẹo ở nồng độ 5 g/L bị ảnh hưởng nhiều hơn, chỉ đạt 0,57 cm ở 5 tuần SKC (Bảng 6).. - Bảng 5: Ảnh hưởng của muối NaCl lên tỷ lệ sống. - của mô sẹo đậu nành MTĐ 760- từ 1 đến 5 tuần sau khi cấy trong lần chọn lọc 3. - Bảng 6: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự gia tăng đường kính (cm) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 từ 1 đến 5 tuần sau khi cấy trong lần chọn lọc thứ 3. - Nhìn chung, trong lần chọn lọc thứ 3, khả năng chịu mặn của mô sẹo đã ổn định hơn và kết quả đã chọn được các mẫu mô sẹo chịu mặn đến nồng độ muối NaCl 5 g/L với tỷ lệ sống khá cao, đạt 94 % sau 5 tuần nuôi cấy.. - 3.4 Ảnh hưởng của muối NaCl đến sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 4. - Bảng 7 cho thấy tỷ lệ sống của mô sẹo ở nồng độ muối 5 g/L trong lần xử lý 4 này mặc dù giảm còn 94% nhưng không khác biệt so với đối chứng. - mô sẹo ở nồng độ này đã ổn định, mô sẹo đã có sự thích nghi với điều kiện stress mặn của môi trường (Hình 2).. - Kết quả Bảng 7 và 8 cho thấy khả năng sống của mô sẹo chịu mặn muối NaCl 2,5 và 5 g/L đã ổn định, tuy nhiên sự sinh trưởng vẫn còn chậm hơn so với đối chứng. - Từ tuần 1 đến tuần 5 SKC, đường kính gia tăng của mô sẹo ở nghiệm thức muối 2,5 g/L tăng từ 0,06 đến 0,66 cm, ở nghiệm thức muối 5 g/L tăng từ 0,06 đến 0,52 cm, ít hơn so với đối chứng tăng từ 0,13 đến 0,88 cm.. - Bảng 7: Ảnh hưởng của muối NaCl lên tỷ lệ sống. - của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 từ 1 đến 5 tuần sau khi cấy trong lần chọn lọc 4. - Bảng 8: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự gia tăng đường kính (cm) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 từ 1 đến 5 tuần sau khi cấy trong lần chọn lọc 4. - Hı̀nh 2: Sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ trên môi trường MS bổ sung muối NaCl sau 5 tuần nuôi cấy trong lần chọn lọc 4 - (A) 0 g/L. - Kết quả phân tích proline ở Bảng 9 cho thấy có sự ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự tích lũy proline trong mẫu mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4.. - Hàm lượng proline cao nhất ở nồng độ muối 5 là 2,78 mol/g tro ̣ng lượng tươi, khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (1,48 mol/g tro ̣ng lượng tươi), tương đương gấp khoảng 1,9 lần so với đối chứng.. - Mô sẹo ở nồng độ muối 2,5 g/L có hàm lượng proline không khác biệt so với đối chứng, cho thấy mô sẹo đậu nành MTĐ có khả năng chịu đựng mức nồng độ muối này một cách bình thường.. - Bảng 9: Hàm lượng proline của mô se ̣o đâ ̣u nành MTĐ 760-4 sau 4 lần cho ̣n lo ̣c với muối NaCl (mol/g tro ̣ng lươ ̣ng tươi) Nồng độ NaCl (g/L) Hàm lượng proline. - thường được các nhà nghiên cứu ghi nhận như là một chỉ tiêu để đánh giá khả năng chống chịu mặn của mô sẹo.. - Hàm lượng proline tăng ở mô sẹo chịu mặn với muối NaCl cũng đã được báo cáo trên cây đậu nành trong nghiên cứu của Liu và Staden (2000) và trên nhiều giống cây trồng khác như đậu phộng (Jain et al., 2001), lúa mạch (Chaudhuri et al., 1997), lúa (Basu et al., 2002), mía (Gandonou et al., 2006)…. - Kết quả tổng hợp được cho thấy, qua 4 lần chọn lọc với muối NaCl, mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 được chọn lọc in vitro trên môi trường stress mặn có khả năng chống chịu mặn đến nồng độ 5 g/L.. - Hàm lượng proline tích lũy cao ở các mẫu mô sẹo này chứng tỏ chúng đã có sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào để có thể thích nghi với điều kiện mặn của môi trường.. - Mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 sinh trưởng bình thường ở nồng muối NaCl 2,5 g/L. - Qua 4 lần chọn lọc đã thu được các mẫu mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 có khả năng chịu mặn với nồng độ muối NaCl 5 g/L và tỷ lệ sống trên 90% sau 5 tuần nuôi cấy. - Nghiên cứu tái sinh cây từ các mẫu mô sẹo chống chịu mặn để tiếp tục đánh giá khả năng chống chịu mặn của cây con.