- Bacillus cereus, Bacillus subtilis, enzyme ngoại bào, khả năng kháng khuẩn, tôm thẻ chân trắng. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập những dòng vi khuẩn Bacillus spp. - Từ hệ tiêu hóa của các mẫu tôm thẻ chân trắng thu từ ao nuôi thuộc địa bàn tỉnh Kiên Giang đã phân lập được 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp. - Kết quả có 11 trên tổng số 20 dòng thể hiện khả năng đối kháng với ít nhất 1 dòng vi khuẩn kiểm định gồm Escherichia coli, Staphyloccocus aureus, Aeromonas sp. - Kết quả cũng cho thấy cả 11 dòng vi khuẩn đều có khả năng sinh ít nhất 2 loại enzyme ngoại bào trong nhóm amylase, cellulase và protease. - Vi khuẩn Bacillus có thể sản xuất một số hợp chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn cạnh tranh. - Bên cạnh đó, Bacillus còn sản xuất kháng sinh polypeptide, chẳng hạn như bacitracin, gramicidin S, polymyxin và tyrotricidin có khả năng chống lại nhiều loài vi khuẩn Gram dương và Gram âm (Balcázar and Luna, 2007). - Enzyme sản xuất bởi các dòng vi khuẩn thuộc chi này chiếm khoảng 50% tổng thị trường enzyme. - phân lập từ hệ tiêu hóa của tôm thẻ chân trắng tại một số huyện thuộc tỉnh Kiên Giang nhằm ứng dụng các dòng vi khuẩn này trong sản. - Vi khuẩn kiểm định: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Aeromonas sp. - 2.2.1 Phân lập các dòng vi khuẩn Bacillus spp.. - 2.2.2 Khảo sát khả năng kháng khuẩn. - (2012) có hiệu chỉnh để kiểm tra khả năng kháng khuẩn của các dòng Bacillus spp. - Các dòng vi khuẩn kiểm định được nuôi tăng sinh trong môi trường LB agar (10 g/L peptone, 5 g/L yeast extract, 10/L g NaCl, 20 g/L agar) trong 24 giờ, khuẩn lạc được cho vào cất nước vô trùng và tiến hành pha loãng dịch nuôi để xác định mật số vi khuẩn. - vi khuẩn Bacillus spp.được nuôi tăng sinh trong 10mL môi trường LB ở điều kiện hiếu khí, ở 37ºC trong 48 giờ (với mật số khoảng 10 8 tế bào/mL), ly tâm 13.000 rpm trong 15 phút ở 5ºC. - Sau đó, đĩa được ủ ở 37ºC trong 24 giờ để vi khuẩn chỉ thị phát triển. - 2.2.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào. - Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào trên môi trường LB agar có bổ sung cơ chất thích hợp theo phương pháp của Trần Thị Bích Quyên (2012) có hiệu chỉnh để phù hợp với điều kiện thí nghiệm.. - Những dòng có khả năng sinh enzyme ngoại bào khi xuất hiện vòng phân giải xung quanh giếng thạch.. - 2.2.4 Khảo sát khả năng chịu mặn. - Khảo sát khả năng chịu mặn của các dòng vi khuẩn theo phương pháp của Trần Vũ Đình Nguyên và ctv. - Nuôi tăng sinh các dòng vi khuẩn Bacillus sp. - Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 2.000 vòng/phút trong 15 phút. - dịch huyền phù vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường LB với thành phần được biến đổi tương ứng, lắc ủ ở 37ºC trong 24 giờ. - Sau đó 24 giờ, tiến hành xác định mật số vi khuẩn trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp pha loãng mẫu và đếm sống (Hoben and Somasegaran, 1982).. - 2.2.5 Khảo sát khả năng chịu pH. - 2.2.6 Định danh các dòng vi khuẩn đã chọn lọc bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA. - Xác định loài của dòng vi khuẩn đã phân lập có khả năng kháng khuẩn, sinh enzyme ngoại bào cao, chịu mặn, chịu pH bằng kỹ thuật sinh học phân tử phương pháp giải trình tự đoạn gene 16S rRNA với mồi xuôi 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’). - Sau đó, trình tự các đoạn gen được o sánh với trình tự gen 16S trên GenBank và định danh các dòng vi khuẩn nghiên cứu với chương trình BLAST/NCBI.. - 3.1 Phân lập các dòng vi khuẩn có đặc điểm giống Bacillus spp.. - Tổng số 20 dòng vi khuẩn thuần từ hệ tiêu của hóa tôm thẻ chân trắng thu ở 4 huyện An Biên, An Minh, Vĩnh Thuận và U Minh Thượng thuộc tỉnh Kiên Giang. - Trong đó, có 6 dòng vi khuẩn phân lập được ở huyện Vĩnh Thuận (chiếm 30. - Các vi khuẩn sau khi được phân lập thuần, tiến hành quan sát và mô tả tế bào, khuẩn lạc. - Trên môi trường LB agar, sau 24 giờ ủ ở 37ºC trong điều kiện hiếu khí, trong tổng số 20 dòng vi khuẩn đã phân lập, khuẩn lạc của 19 dòng có màu trắng đục (chiếm 95%) và 1 dòng có màu trắng ngà (chiếm 5. - Đường kính khuẩn lạc của 20 dòng vi khuẩn dao động từ 1 đến 4 mm.. - Hình 1: Một số hình thái khuẩn lạc phổ biến của các dòng vi khuẩn có đặc điểm giống Bacillus. - Kết quả kiểm tra một số đặc điểm hình thái và sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập được cho thấy, khuẩn lạc sau khi cấy trên môi trường LB agar sau 24 giờ, ở 37°C đều có dạng hình tròn hoặc không. - Các đặc tính này của các dòng vi khuẩn phân lập phù hợp với công bố của Holt et al. - Vì vậy, có thể kết luận được rằng 20 dòng vi khuẩn được từ hệ tiêu hóa tôm thẻ chân trắng ở 4 huyện của tỉnh Kiên Giang là vi khuẩn Bacillus spp.. - 3.2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các dòng Bacillus spp.. - Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của bacteriocin thô sản xuất bởi 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp. - đối với các dòng vi khuẩn kiểm định cho thấy có 11 trên tổng số 20 dòng vi khuẩn khảo sát thể hiện được khả năng đối kháng với các dòng vi khuẩn kiểm định ở những mức độ khác nhau (Bảng 1).. - Bảng 1: Khả năng kháng khuẩn của bacteriocin sản xuất bởi các dòng vi khuẩn Bacillus spp. - đối với các dòng vi khuẩn kiểm định. - Dòng vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm). - Kết quả cho thấy chỉ có dòng AM2 thể hiện khả năng đối kháng với cả 4 dòng vi khuẩn kiểm định, 3 dòng AM3, AB8 và AM19 có khả năng kháng đối với 3 dòng vi khuẩn kiểm định. - Khả năng đối kháng. - của các dòng vi khuẩn khảo sát đối với các vi khuẩn gây bệnh là do chúng có khả năng sản xuất bacteriocin. - Bacteriocin có thể ức chế vi khuẩn Gram dương và Gram âm như các loài Salmonella. - sinh ra những loại bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng sẽ thể hiện được khả năng ức chế đối với nhiều dòng vi khuẩn khác nhau bao gồm cả Gram âm hoặc Gram dương, ngược lại, những dòng chỉ có khả năng sinh ra những loại bacteriocin có phổ tác động hẹp thì khả năng kháng khuẩn sẽ hạn chế hơn. - Điều này giải thích cho khả năng đối kháng với nhiều dòng vi khuẩn kiểm định của các dòng AM2, AM3, AB8 và AM19. - đều có hoạt động chống lại vi khuẩn Gram dương, mặc dù có những trường hợp ngoại lệ (Slepecky and Hemphill, 2006). - Những dòng không thể hiện được khả năng đối kháng có thể do chúng không có khả năng sinh ra bacteriocin hoặc các dòng vi khuẩn kiểm định trong nghiên cứu này không phải là đối tượng tác động của những bacteriocin mà chúng sinh ra.. - Kannahi and Eshwari (2016) đã phân lập được 4 dòng vi khuẩn B. - cereus từ đất và nước biển đều có khả năng ức chế các dòng vi sinh vật thử nghiệm Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, E. - cereus có khả năng sinh enzyme ngoại bào cao đồng thời thể hiện khả năng đối kháng với cả các dòng vi khuẩn kiểm định gồm Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Aeromonas hydrophila, Bacillus subtilis và Vibrio harveyi.. - Hình 2: Khả năng kháng khuẩn của bacteriocin sản xuất bởi dòng AM2 đối với E. - 3.3 Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các dòng Bacillus spp.. - Các vi sinh vật có khả năng tiết các enzyme ngoại bào để phân hủy các chất cặn bã, thức ăn thừa tồn đọng trong ao, hạn chế khả năng gây bệnh của các dòng vi khuẩn gây bệnh. - Do đó, khả năng sinh enzyme ngoại bào là một tiêu chí quan trọng khi chọn lọc các dòng vi khuẩn làm probiotic (Nguyễn Văn Phúc và Phan Thị Phượng Trang, 2014). - Vì vậy, 11 dòng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn từ thí nghiệm trên sẽ được tiến hành khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. - Các dòng vi khuẩn khác nhau có khả năng sinh ra các loại ezyme ngoại bào khác nhau phân giải các cơ chất tương ứng được bổ sung vào môi trường.. - Bảng 2 cho thấy 11 dòng vi khuẩn Bacillus spp.. - đều có khả năng sinh ít nhất một loại enzyme ngoại bào gồm amylase, cellulase và protease. - (2015) khi khảo sát tiềm năng probiotic của 2 dòng Bacillus licheniformis và Bacillus pumilus chọn lọc từ 26 dòng vi khuẩn Bacillus spp. - Bảng 2: Khả năng sinh enzyme n goại bào của các dòng Bacillus spp.. - những dòng có khả năng sinh enzyme ngoại bào. - Hình 3: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của dòng vi khuẩn AM2: amylase (A), cellulase (B). - 3.4 Đánh giá khả năng chịu mặn của dòng AM2 và AM3. - Hai dòng vi khuẩn AM2 và AM3 thể hiện khả năng kháng khuẩn và sinh enzyme ngoại bào cao được tiến hành khảo sát khả năng chịu mặn, chịu pH sẽ được khảo sát khả năng sinh trưởng ở những nồng độ muối khác nhau để kiểm tra khả năng tương thích đối với môi trường nước nuôi tôm.. - Hình 4: Khả năng chịu mặn của dòng AM2 và AM3 sau 24 giờ nuôi cấy. - Hình 4 cho thấy cả 2 dòng vi khuẩn AM2 và AM3 đều có khả năng phát triển trong môi trường được bổ sung NaCl với nồng độ từ 1-5%, tuy nhiên chúng phát triển tốt nhất trong môi trường được bổ sung NaCl với các nồng độ từ 1-4%. - Đồng thời, khả năng sinh trưởng của cả 2 dòng vi khuẩn đều giảm trong môi trường được bổ sung NaCl với nồng độ lớn hơn 4%. - Khả năng hình thành bào tử là nguyên nhân quan trọng giúp Bacillus spp. - Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Văn Phúc và Phan Thị Phượng Trang (2014) khi khảo sát các đặc tính có lợi của 2 dòng vi khuẩn Bacillus subtilis BN1 và BD23.1 phân lập từ ao nuôi tôm ở tỉnh Bến Tre, cả 2 dòng đều có khả năng sinh trưởng trong môi trường được bổ sung muối với các nồng độ từ 0-5%, trong đó chúng phát triển tốt nhất ở nồng độ muối từ 0-2%. - (2016), dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis CIGBC-232 phân lập từ ruột tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối từ 2-7% và không sinh trưởng được trong môi trường có nồng độ muối 7,5%. - (2016) cũng cho thấy cả 2 dòng vi khuẩn B. - 3.5 Đánh giá khả năng chịu pH của dòng AM2 và AM3. - Hai dòng vi khuẩn AM2 và AM3 sẽ được khảo sát khả năng sinh trưởng ở những mức pH khác nhau để kiểm tra khả năng tương thích đối với môi trường nuôi thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng.. - Hình 5: Khả năng chịu pH của dòng AM2 và AM3 sau 24 giờ nuôi cấy. - Hình 5 cho thấy cả 2 dòng vi khuẩn AM2 và AM3 đều có khả năng phát triển trong môi trường có pH dao động từ 4-9, tuy nhiên ở giá trị pH dưới 5, khả năng sinh trường của cả 2 dòng đều giảm so với ở các giá trị pH còn lại. - Khả năng sinh trưởng trong môi trường kiềm hoặc acid của vi khuẩn Bacillus spp. - Hơn nữa, các dòng vi khuẩn Bacillus spp. - còn có khả năng tạo biofilm, tạo điều kiện cho sự sống còn của vi khuẩn trong môi trường có pH cao, nghèo dinh dưỡng hoặc các điều kiện bất lợi khác của môi trường (Gingichashvili et al., 2017). - (2015) khi khảo sát khả năng sinh trưởng của các. - dòng vi khuẩn phân lập từ sò huyết (Anadara tuberculosa) trong môi trường có pH thay đổi từ 4- 10, ở mức pH dưới 5 khả năng sinh trưởng của tất cả các dòng Bacillus phân lập được gồm B.. - (2014) khi khảo sát khả năng sinh trưởng của 3 dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, B. - licheniformis phân lập từ ruột của ấu trùng cá Thát Lát (Chitala chitala) cho thấy cả 3 dòng đều có khả năng phát triển trong môi trường có pH từ 4-10, tuy nhiên chúng phát triển tốt nhất ở pH từ 8-10. - (2014) khi khảo sát đặc tính probiotic của 3 dòng vi khuẩn B. - pumilus BP, Bacillus HL7 phân lập từ cua biển (Scylla paramamosain) cũng cho thấy cả 3 dòng vi khuẩn đều không thể sinh trưởng ở pH dưới 2 và có khả năng sinh trưởng ở mức pH từ 3-7,4, trong đó cả 3 dòng phát triển tốt nhất ở pH 7,4 với mật số trung bình từ logCFU.mL-1.. - 3.6 Kết quả định danh các dòng vi khuẩn chọn lọc được bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA. - Từ các thử nghiệm khả năng kháng khuẩn và sinh enzyme ngoại bào, chịu mặn, chịu pH, tuyển chọn hai dòng vi khuẩn AM2 và AM3 được gửi đi giải trình tự. - Kết quả so sánh trình tự vùng gen 16S rRNA của dòng AM2 và AM3 với các trình tự trên cơ sở dữ liệu của NCBI cho thấy dòng vi khuẩn AM2 tương đồng 99% với Bacillus subtilis và và dòng AM3 tương đồng 99% với dòng Bacillus cereus đã được đăng ký trên GenBank với mã số lần lượt là MN907469 và MN907471.. - Nghiên cứu đã phân lập được 20 dòng vi khuẩn Bacillus spp. - Trong đó, có 11 trong tổng số 20 dòng thể hiện khả năng đối kháng với ít nhất 1 dòng vi khuẩn kiểm định gồm Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Aeromonas sp., Pseudomonas sp., đồng thời cả 11 dòng đều có khả năng sinh ít nhất 1 loại enzyme ngoại bào gồm amylase, cellulase và protease. - Dòng AM2 và AM3 thể hiện khả năng kháng khuẩn và sinh enzyme ngoại bào cao được tiến hành khảo sát khả năng chịu mặn, chịu pH. - Kết quả cho thấy cả 2 dòng đều có khả năng phát triển trong môi trường được bổ sung nồng độ muối từ 1-5% và pH từ 4-9.. - Qua đó có thể thấy cả 2 dòng vi khuẩn đều có các. - Nghiên cứu hoạt tính enzyme ngoại bào của một số dòng Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải. - Phân lập và xác định khả năng gây hoại tử gan tụy của vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus phân lập từ tôm nuôi ở Bạc Liêu, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ