- KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA VÀ KHÁNG KHUẨN CỦA CAO PHÂN ĐOẠN SẮC KÝ CỘT SILICA GEL TỪ CAO CHIẾT LÁ CÀ NA. - Nghiên cứu nhằm mục đích khảo sát khả năng kháng oxy hóa và kháng vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus của cao phân đoạn sắc ký cột silica gel từ cao chiết lá cây cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz. - Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu suất thu hồi cao chiết cao nhất ở phân đoạn F4 (20,32. - Hàm lượng flavonoid (211,33 QE/g cao chiết) cao nhất ở phân đoạn F1. - Hàm lượng polyphenol tổng mg GAE/g cao chiết), tannin tổng mg TAE/g cao chiết) cao nhất ở phân đoạn F2. - Giá trị MIC: E. - Giá trị MBC: E. - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn của cao phân đoạn sắc ký cột silica gel từ cao chiết lá cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz. - Cao phân đoạn điều chế bằng cách dùng 69,8592 (g) cao thô ethanol (CT) từ lá cà na (thu được bằng phương pháp chiết rắn - lỏng kết hợp với đánh sóng siêu âm ở tần số 120 W, trong 60 phút, tỷ lệ mẫu : dung môi là 1 : 5 (w/v. - dichloromethane, ethyl acetate, acetone, methanol theo các tỉ lệ ở các phân đoạn như sau: F1 (dichloromethane : ethyl acetate tỉ lệ 1 : 1 (v/v. - 2.2.2 Khảo sát hàm lượng polyphenol tổng trong cao phân đoạn. - Lần lượt cho 0,1 mL dung dịch cao chiết nồng độ lần lượt là CT, F1, F3, F4 (0,3 mg/mL) và F2 (0,15 mg/mL) trong methanol và 1 mL dung dịch Folin-Ciocalteu 10% vào ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ 25 o C và để phản ứng trong vòng 5 phút. - Kết quả được thể hiện bằng mg gallic acid (GAE)/g cao chiết.. - Hàm lượng polyphenol tổng: C = 𝑐∗𝑉. - Trong đó, C: hàm lượng polyphenol tổng (mg GAE /g cao chiết). - V: thể tích cao chiết (mL). - m: khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g).. - Kết quả được thể hiện bằng mg quercetin (QE)/g cao chiết.. - Hàm lượng flavonoid tổng: F = c*V. - Trong đó, F: hàm lượng flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết). - khối lượng cao chiết có trong V(g).. - 2.2.4 Khảo sát hàm lượng tannin tổng. - Lần lượt cho 0,25 mL dung dịch cao chiết nồng độ lần lượt là F3, F4 (0,1 mg/mL), CT (0,2 mg/mL), F1 (0,5 mg/mL) và F2 (0,05 mg/mL). - Kết quả được thể hiện bằng mg tannic acid (TAE)/g cao chiết.. - Hàm lượng tannin tổng: C= c*V. - Trong đó, C: hàm lượng tannin tổng (mg tannic acid/g cao chiết). - khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g).. - Lần lượt cho 0,5 mL cao chiết với nồng độ lần lượt là CT µg/mL), F µg/mL), F µg/mL), F µg/mL), F µg/mL) và 2,5 mL H 2 O 2 vào mỗi ống nghiệm. - 2.2.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết phân đoạn lá cây cà na bằng khả năng khử ion Fe3+. - Lần lượt cho 90 µL cao chiết với nồng độ lần lượt là CT (7 - 14 µg/mL), F1 (35 - 47 µg/mL), F2 (4 - 11 µg/mL), F3 (8 - 15 µg/mL), F4 (12 - 27 µg/mL) vào ống nghiệm có chứa 225 µL dung dịch đệm phosphate 0,2 M (pH. - Mẫu trắng được thay thế cao chiết bằng nước khử ion.. - Cao chiết mỗi loại được pha loãng trong dimethyl sulfoxide (DMSO) 100% để đạt nồng độ 100 mg/mL. - 2.2.8 Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) đối với vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli. - Pha loãng cao phân đoạn trong DMSO 100% để đạt được dãy nồng độ khảo sát. - Hút 200 µL môi trường LB lỏng cho vào mỗi tube Eppendorf, bổ sung thêm 250 µL dịch huyền phù vi khuẩn, bơm 50 µL cao chiết ở mỗi nồng độ khác nhau, ủ các tube mẫu ở 37 o C trong 24 giờ. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả điều chế cao phân đoạn Từ cao thô lá cà na mang đi sắc ký cột với các dung môi có độ phân cực tăng dần dichloromethane, ethyl acetate, acetone, methanol thu được khối lượng cao ở mỗi phân đoạn (Bảng 1).. - Bảng 1: Hiệu suất điều chế cao phân đoạn lá cà na bằng phương pháp sắc ký cột Phân. - Phân đoạn F4 ly trích trong dung môi methanol thu được 14,1982 g có hiệu suất cao nhất (20,32%). - và phân đoạn F1 thu được 4,1636 g có hiệu suất thấp nhất (5,96. - Hiệu suất thu hồi cao tại các phân đoạn phụ thuộc vào độ phân cực của các hợp chất thực vật hiện diện trong hỗn hợp cao chiết và độ phân cực của dung môi dùng chiết cao. - Có thể do hàm lượng các hợp chất thực vật có tính phân cực hiện diện nhiều trong lá cà na nên F3, F4 cho hiệu suất thu hồi cao chiết tốt hơn so với F1 và F2.. - 3.2 Kết quả định lượng polyphenol tổng trong cao phân đoạn. - Dựa vào phương trình đường chuẩn gallic acid (y = 0,0031x - 0,0094 với R để xác định hàm lượng polyphenol tổng trong các phân đoạn.. - Hình 1: Hàm lượng polyphenol tổng có trong cao thô và các cao phân đoạn lá cà na. - Ghi chú: Hàm lượng polyphenol tổng là giá trị trung bình của ba lần lặp lại. - Nhìn chung, tất cả các phân đoạn cao chiết đều chứa các hợp chất polyphenol. - Phân đoạn có hàm lượng polyphenol tổng cao nhất là F2 (465,38 mg GAE/g cao chiết) và F1 có hàm lượng polyphenol tổng thấp nhất (117,28 mg GAE/g cao chiết). - Phân đoạn F2 được ly trích trong dung môi acetone là dung môi có độ phân cực trung bình. - Ngoài ra, ở các phân đoạn khác vẫn chứa hàm lượng polyphenol nhất định do một số phân tử polyphenol có nhóm chức phân cực cao hoặc ít phân cực có thể hòa tan được trong dung môi phân cực cao như methanol hoặc ít phân cực như chloroform và ethyl acetate (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).. - xác định hàm lượng flavonoid tổng trong các phân đoạn.. - Hình 2: Hàm lượng flavonoid tổng có trong cao thô và các cao phân đoạn lá cà na. - Ghi chú: Hàm lượng flavonoid tổng là giá trị trung bình của ba lần lặp lại. - Phân đoạn F1 với 211,33 mg QE/g cao chiết có hàm lượng flavonoid tổng cao nhất . - Tiếp theo là phân đoạn F2 (76,87 mg QE/g cao chiết), F3 (23,37 mg QE/g cao chiết) khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với cao thô (22,17 mg QE/g cao chiết) và ít nhất là phân đoạn F4 (11,39 mg QE/g cao chiết). - Có thể trong cà na cũng chứa nhiều flavonoid ít phân cực hòa tan tốt trong dichloromethane và ethyl acetate nên phân đoạn F1 cho kết quả hàm lượng flavonoid tổng cao nhất trong các phân đoạn. - Điều này giải thích tại sao các phân đoạn có tính phân cực cao và trung bình như F3, F4 vẫn chứa hàm lượng flavonoid tổng nhất định.. - 3.4 Khảo sát hàm lượng tannin tổng Dựa vào phương trình đường chuẩn của tannic acid (y = 0,0093x + 0,026 với R để xác định hàm lượng tannin tổng trong từng phân đoạn.. - Hình 3: Hàm lượng tannin tổng có trong cao thô và các cao phân đoạn lá cây cà na. - Ghi chú: Hàm lượng tannin tổng là giá trị trung bình của ba lần lặp lại. - Phân đoạn F2 cho hàm lượng tannin tổng nhiều nhất (782,80 mg TAE/g cao chiết), thấp nhất là phân đoạn F1 với hàm lượng tannin tổng là 214,77 mg TAE/g cao chiết. - F2 là phân đoạn với dung môi acetone là chính, vì thế dung môi ít phân cực ở cuối phân đoạn F1 có thể còn lưu lại ở đầu phân đoạn F2, tạo nên sự kết hợp giữa dung môi phân cực và ít phân cực, từ đó phân đoạn F2 ly trích được nhiều tannin hơn F3.. - 3.5 Khảo sát khả năng khử H 2 O 2 của cao phân đoạn. - Phân đoạn F2 (phân tách trong acetone : ethyl acetate, 9 : 1) cho khả năng khử H 2 O 2 mạnh nhất với giá trị IC 50 là 20,81 µg/mL, kháng yếu nhất là F1 (115,00 µg/mL). - (2015) đã nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của cao chiết lá cây rau muối (Chenopodium album) trong dung môi methanol và ethyl acetate cho thấy phân đoạn methanol khử mạnh gấp 1,7 lần so với phân đoạn ethyl acetate. - Từ những dữ liệu trên đã chứng minh được sự ảnh hưởng rất lớn của dung môi, ở những phân đoạn được ly trích bằng những dung môi khác nhau sẽ cho khả năng kháng oxy hóa khác. - 3.6 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết phân đoạn lá cây cà na bằng khả năng khử ion Fe 3+. - 4,3217x – 114,7 với R F2 (y = 13,619x – 50,754 với R F3 (y = 7,829x – 43,84 với R F4 (y = 7,412x – 79,295 với R để xác định các giá trị IC 50 cho từng phân đoạn.. - Bảng 2: Giá trị IC 50 của vitamin C, cao thô và các phân đoạn cao chiết lá cà na trong thí nghiệm kháng oxy hóa khử H 2 O 2 và khử ion Fe 3+. - Phân đoạn Nồng độ ức chế 50 % (IC 50 , µg/mL). - Từ kết quả thí nghiệm, tất cả các phân đoạn đều có năng lực khử ion Fe 3+ với giá trị IC 50 dao động từ 2,53 µg/mL đến 38,13 µg/mL. - Phân đoạn F2 cho khả năng khử ion Fe 3+ mạnh nhất (IC 50 tương ứng là 7,40 µg/mL), yếu nhất là phân đoạn F1 (38,13 µg/mL). - Cao chiết acetone của cây Lepidagathis keralensis (họ ô rô) cho khả năng khử Fe 3+ cao hơn cả cao chiết nước, methanol và petroleum ether (Leena et al., 2017). - Độ phân cực của dung môi được sử dụng để ly trích sẽ ảnh hưởng đến khả năng khử ion Fe 3+ của của cao chiết thực vật và dung môi acetone đã được chứng minh là có hiệu quả nhất.. - Khả năng khử ion Fe 3+ của các phân đoạn cao chiết lá cà na còn chịu ảnh hưởng từ các nhóm chất polyphenol, tannin. - Do đó, hợp chất polyphenol, tannin của cao chiết thực vật có chức năng như là nguồn electron và hydro nguyên tử để có thể khử các gốc tự do.. - Nhìn chung các phân đoạn cao phân đoạn lá cây cà na đều cho hiệu quả kháng L. - Phân đoạn F2 cho hiệu quả ức chế mạnh nhất trong các phân đoạn đối với 4 dòng vi khuẩn L. - Các hợp chất tự nhiên trong phân đoạn F2 có khả năng chứa các gốc hóa học có khả năng cố định màng tế bào, các kênh tín hiệu và sự trao đổi chất của các vi khuẩn gram âm như E. - Bảng 3: Giá trị ĐKVVK giữa 5 phân đoạn cao chiết với 4 dòng vi khuẩn, ở nồng độ 100 mg/mL, L.. - coli ở nồng độ 100 mg/mL Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các loại cao chiết. - 3.8 Kết quả khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) đối với vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli. - Theo kết quả của thí nghiệm xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của phân đoạn F2 đối với vi khuẩn B. - Cao chiết bột khô của lá cây Elaeocarpus sphaericus (cây cùng chi với cây cà na) trong dung môi acetone cho khả năng kháng B.. - subtilis với giá trị MIC tại nồng độ 0,125 mg/mL (Singh and Gopal, 1999). - Cao chiết bột khô của lá cây Elaeocarpus ganitrus Roxb. - subtilis phụ thuộc vào dãy nồng độ của phân đoạn cao phân đoạn F2. - Khi tăng nồng độ của cao chiết thì hiệu quả ức chế B. - Nguyên nhân chưa tìm được giá trị MBC có thể là do nồng độ chất trong cao chiết và liên quan khả năng tổng hợp màng sinh học của B. - Bảng 4: Giá trị MIC và MBC của phân đoạn F2 đối với vi khuẩn B. - Nồng độ (mg/mL). - Theo kết quả của thí nghiệm xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của phân đoạn F2 đối với vi khuẩn E. - coli với giá trị MIC tại nồng độ 0,5 mg/mL (Kumar and Kokati, 2011). - Cao chiết bột khô Elaeocarpus serratus trong dung môi ethanol cho khả năng kháng E. - coli của cao chiết lá cà na trong dung môi acetone tương đương với các nghiên cứu gần đây thuộc chi Elaeocarpus.. - Bảng 5: Giá trị MIC và MBC của phân đoạn F2 đối với vi khuẩn E. - Nồng độ Mật số vi khuẩn (CFU/mL). - Qua kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn của cao phân đoạn chiết xuất từ lá cà na bằng sắc ký cột silicagel, ở các phân đoạn cao chiết đều có khả năng kháng oxy hóa và kháng các loài vi khuẩn khảo sát với mức độ khác nhau tùy theo độ phân cực của dung môi dùng để chiết cao.. - Trong đó phân đoạn cao chiết bằng dung môi acetone (F2) cho hiệu quả kháng oxy hóa qua khả năng khử Fe 3+ và H 2 O 2 , cũng như khả năng kháng các loài vi khuẩn E. - aureus cao hơn so với các phân đoạn khác. - Đây là cơ sở để nghiên cứu sâu hơn các thành phần hợp chất có hoạt tính sinh học trong phân đoạn F2.