- KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE TỪ Aspergillus oryzae TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN Lê Nguyễn Đoan Duy 1 , Huỳnh Thị Phương Thảo 1 và Nguyễn Công Hà 1. - Nghiên cứu được tiến hành với mục đích khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease từ Aspergillus oryzae trên môi trường bán rắn với cơ chất cảm ứng là gelatin cũng như xác định các thông số động học của enzyme như pH, nhiệt độ tối ưu, V max và K m . - Kết quả cho thấy thành phần môi trường bán rắn nuôi cấy thích hợp là hỗn hợp 70% cám, 25% trấu, 5% gelatin với độ ẩm môi trường là 60%, nhiệt độ ủ 30 o C, pH 5 trong thời gian 72 giờ. - Enzyme thu hồi thể hiện hoạt tính tối ưu ở nhiệt độ 45 o C và pH = 5,5. - Khả năng thủy phân của enzyme protease trong dịch acid protein (da cá tra ngâm acid acetic trong 24 giờ ) ứng với thời gian thuỷ phân là 50 phút với thể tích dung dịch enzyme là 1mL protein, pH dung dịch là 3,2 và nhiệt độ thuỷ phân là 45 o C. - Kết quả đã chỉ ra rằng, enzyme protease có nguồn gốc từ Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên môi trường bán rắn có khả năng sử dụng tốt trong việc thủy phân dung dịch protein.. - Độ pH môi trường nuôi cấy có một ý nghĩa rất lớn đến chủng vi sinh vật và sự tổng hợp enzyme theo mong muốn. - Dịch chiết protease kiềm thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79 UI/g (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1(w/w). - nhiệt độ 35 o C trong thời gian 10 phút. - Nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme thô trên cơ chất casein là 55 o C và pH 10-12.. - Khi cho cơ chất vào môi trường nuôi cấy với liều lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng sẽ tăng dần, đến một lúc nào đó quá trình này sẽ chựng lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu bởi cơ chất gây nên (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). - oryzae trên môi trường bán rắn, nghiên cứu này đã được thực hiện.. - Aspergillus oryzae nhận được từ Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ được nuôi cấy trên bề mặt thạch môi trường PGA (Potato, Glucose, Agar) và đem ủ ở 30 o C trong 3 ngày để tăng sinh. - 2.2.1 Ảnh hưởng của thành phần và pH ban đầu của môi trường lên men sinh tổng hợp protease. - Thí nghiệm được tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường ban đầu, gồm 3 nghiệm thức: (1) 75% cám, 15% trấu và 10% gelatine;. - (3) 70% cám, 25% trấu, 5% gelatin và tác động của pH ban đầu của môi trường lên men, gồm 4 mức độ khảo sát từ 3 đến 6 đến hiệu quả thu nhận protease. - Sau khi thanh trùng ở 121 o C trong 15 phút, môi trường được làm nguội trước khi chủng 1 mL huyền phù bào tử nấm A. - Lọc thu nhận enzyme, bảo quản chế phẩm enzyme thô ở nhiệt độ khoảng 5 o C và tiến hành khảo sát hoạt tính tổng, hoạt tính riêng protease theo phương pháp Kunitz.. - Nhiệt độ và pH tối thích của enzyme: Chế phẩm protease từ A. - oryzae thu nhận được hòa tan vào dung dịch đệm có pH tương ứng từ 4 đến 6,5 (6 mức độ) trước khi ủ ở các nhiệt độ khảo sát từ 35 đến 55C (khoảng cách 5C). - Tiến hành xác định hoạt tính protease ở các nghiệm thức. - Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzyme protease: Cơ chất được sử dụng là casein với nồng độ từ phản ứng thuỷ phân được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 45 o C, pH 5,5. - Dung dịch sau khi lọc có chứa enzyme protease được đem xác định hoạt tính theo phương pháp Kunitz. - tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 45 o C với thời gian thay đổi từ 10 đến 60 phút. - Đánh giá hiệu quả thuỷ phân protein dựa trên hàm lượng protein còn lại và lượng tyrosine sinh ra theo thời gian thủy phân.. - 3.1 Ảnh hưởng của môi trường và pH đến quá trình sinh tổng hợp protease. - Thành phần môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. - Thành phần chính của môi trường nuôi cấy nấm mốc A.. - Tuy nhiên, cần cho thêm 20 ÷ 25% trấu vào môi trường để tạo độ xốp và tạo nên những khoảng trống để không khí lưu thông bên trong môi trường một cách dễ dàng (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2004).. - Giá trị pH ban đầu của môi trường nuôi cấy là một trong những nhân tố có ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. - Kết quả thống kê ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy và pH ban đầu đối với sự thay đổi hoạt tính tổng protease và hoạt tính riêng của protease được thể hiện ở Bảng 1.. - Bảng 1: Ảnh hưởng của thành phần và pH ban đầu của môi trường đến hoạt tính của protease Thành phần. - môi trường. - pH ban đầu của môi trường. - Hoạt tính protease (TU/mL). - Hoạt tính riêng (TU/mg protein) Môi trường 1:. - Môi trường 2:. - Môi trường 3:. - Thành phần môi trường và pH ban đầu của môi trường lên men có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả thu nhận protease. - Hoạt tính protease thu được tương ứng với 3 môi trường nuôi cấy có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%, trong đó môi trường nuôi cấy sử dụng kết hợp 70%. - cám và 25% trấu với sự hiện diện của 5% gelatine cho hoạt tính enzyme trung bình cao nhất, đặc biệt ở pH ban đầu của môi trường là 5 (hoạt tính protease tương ứng thu được là 1,126 TU/mL).. - Ngoài ra, pH môi trường cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. - Hoạt tính protease thu được tương ứng với quá trình lên men A. - môi trường có pH 3 và pH 6 không có sự khác biệt ý nghĩa nhưng khác biệt so với mẫu trích từ môi trường có pH 4 và 5 ở độ tin cậy 95%. - Ở điều kiện pH môi trường nuôi cấy là 5 có hoạt tính enzyme trung bình là cao nhất (0,969TU/mL) và pH 3 có hoạt tính enzyme trung bình thấp nhất khi thay đổi thành phần môi trường lên men khác nhau. - Thành phần môi trường có chứa 25% trấu giúp tăng khả năng hoạt động của nấm mốc, tạo thuận lợi cho quá trình tổng hợp enzyme nhiều hơn. - Việc bổ sung cơ chất cảm ứng là 5% gelatin trong môi trường đã đủ để nấm mốc sinh enzyme protease có hoạt lực cao nhất. - Như vậy, thành phần môi trường thích hợp. - Mặc dù, quá trình nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt không chịu ảnh hưởng lớn của pH môi trường, tuy nhiên, pH ban đầu của môi trường cũng có ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình phát triển của nấm mốc và tạo ra enzyme. - Kết quả từ Bảng 1 và 2 cho thấy hoạt tính enzyme tăng khi pH môi trường ban đầu có sự thay đổi. - Hoạt tính enzyme tăng khi tăng pH môi trường từ 3 ÷ 5 nhưng khi pH môi trường bằng 6 thì hoạt tính enzyme lại giảm xuống. - Theo Lê Xuân Phương (2004), môi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc là môi trường acid yếu. - Tương tự như hoạt tính tổng của enzyme protease, hoạt tính riêng của protease tăng khi có sự thay đổi pH môi trường và thành phần môi trường. - Hoạt tính riêng của enzyme tăng đến giới hạn tối đa thì có xu hướng giảm xuống, hoạt tính enzyme tăng từ pH 3 đến pH 5 và giảm khi pH 6.. - Thành phần môi trường 70% cám: 25% trấu :5%. - gelatinecho enzyme có hoạt tính riêng cao (1,338 TU/mg) và cũng khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. - Đây chính là thành phần môi trường được chọn lựa, thích hợp cho nấm mốc phát triển và sinh tổng hợp enzyme có hoạt lực khi kết hợp với việc điều chỉnh pH môi trường ban đầu là 5.. - 3.2.1 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính của hệ enzymeprotease. - tối ưu trên sẽ được lọc và tinh sạch sơ bộ và được dung để khảo sát pH và nhiệt độ tối ưu. - Dựa vào kết quả ở Hình 1 cho thấy ở mỗi nhiệt độ và pH khác nhau enzyme thể hiện hoạt tính xúc tác khác nhau. - Ở những nhiệt độ khác nhau hoạt tính enzyme giữa các nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% (số liệu không trình bày). - Nhiệt độ 45 o C khác biệt so với nhiệt độ 35 o C, 40 o C, 50 o C và 55 o C ở độ tin cậy 95% và có hoạt tính enzyme trung bình cao nhất (1,552 TU/mL). - Hình 1 còn cho thấy khi gia tăng nhiệt độ phản ứng từ 35 o C đến 55 o C, hoạt tính enzyme tăng dần theo nhiệt độ.. - Nhưng khi nhiệt độ tăng lên đến 45 o C thì hoạt tính enzyme trung bình là cao nhất (1,552 TU/mL), khi nhiệt độ tăng cao hơn nữa thì hoạt tính enzyme không tăng thêm mà bắt đầu có xu hướng giảm mạnh do xảy ra hiện tượng biến tính nhiệt của enzyme. - Ở nhiệt độ 45 o C hoạt tính enzyme trung bình là cao nhất (1,552 TU/mL) khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. - Như vậy, nhiệt độ 45 o C được xem là nhiệt độ tối ưu của phản ứng enzyme.. - Tương tự đối với nhiệt độ, khi thay đổi pH thì hoạt tính xúc tác của enzyme cũng thay đổi. - pH khác nhau hoạt tính enzyme giữa các nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. - 6 và 6,5 ở độ tin cậy 95% và cho hoạt tính enzyme trung bình cao nhất (0,935 TU/mL) (số liệu không trình bày).. - Kết quả ở Hình 1 cho thấy pH và nhiệt độ tối ưu là 45 o C và pH 5,5.. - Hoạt tính X – 0,01X 2 – 0,03XY – 0,04Y 2 +1,61Y. - Hình 1: Sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme protease Trong đó: X là nhiệt độ và Y là pH. - 40 Nhiệt độ (oC). - Cơ chất được sử dụng là casein với nồng độ từ phản ứng thuỷ phân được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 45 o C, pH 5,5. - Kết quả cho thấy hoạt tính enzyme cao nhất ứng với nồng độ cơ chất là TU/mL) khác biệt không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% so với nồng độ cơ chất là 1,0%.. - Khi tăng nồng độ cơ chất vượt quá giới hạn tối ưu thì hoạt tính enzyme gần như không tăng.. - 3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzyme protease. - Hình 2: Ảnh hưởng của nồng độ casein lên hoạt tính protease theo phương trình Michaelis – Menten 3.3 Khả năng thuỷ phân của protease trên. - dung dịch acid protein. - Dựa vào những điều kiện tối ưu về nhiệt độ và pH, việc khảo sát khả năng thuỷ phân của protease trên dung dịch acid protein (da cá tra ngâm acid acetic trong 24 giờ) đã được thực hiện. - Dung dịch acid protein có pH dung dịch là 3,2, nhiệt độ thủy phân được cố định ở 45 o C. - Dựa vào kết quả thống kê ở Bảng 2 cho thấy hàm lượng protein hoà tan còn lại sau quá trình thuỷ phân giữa các nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. - Thời gian thuỷ phân 50 và 60 phút khác biệt so với thời gian thuỷ phân là và 40 phút ở độ tin cậy 95% và có hàm lượng protein còn lại trong dung dịch là thấp nhất (0,082 mg/mL). - Thời gian đầu (0 phút) do chưa bổ sung enzyme, hàm lượng protein trong dung dịch acid protein còn cao (0,341 mg/mL). - Điều này là do enzyme đã thuỷ phân dung dịch acid protein tạo ra. - Nhưng từ 50 phút trở đi hàm lượng protein hoà tan không giảm nữa, có thể do hàm lượng protein trong dung dịch không còn nữa, hàm lượng protein đo được lúc này chỉ là hàm lượng protein còn lại của enzyme sau khi thuỷ phân và cũng có thể là do hoạt tính enzyme bắt đầu giảm và mất hẳn nên không thuỷ phân hết lượng protein còn lại trong dung dịch acid protein.. - Bảng 2: Hàm lượng protein còn lại và lượng tyrosine sinh ra sau quá trình thuỷ phân. - Thời gian thuỷ phân (phút). - Hàm lượng protein (mg/mL). - Lượng tyrosine sinh ra trong quá trình thuỷ phân giữa các nghiệm thức cũng có sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. - Thời gian thủy phân 50 và 60 phút khác biệt so với thời gian thuỷ phân là và 40 phút ở độ tin cậy 95% và có hàm lượng tyrosine sinh ra cao nhất trong quá trình thuỷ phân. - Nhưng thời gian thuỷ phân 30 và 40 phút khác biệt không có ý nghĩa. - Thời gian thuỷ phân 10 phút có hàm lượng tyrosine thấp nhất (0,698 µmol/. - Do quá trình xử lý nhiệt trong môi trường ẩm, các sợi collagen bị co ngắn lại. - Như vậy, để tiết kiệm chi phí cho quá trình thuỷ phân thời gian thích hợp là 50 phút.. - oryzae sinh tổng hợp protease đạt hoạt tính tổng cao nhất thì điều kiện môi trường bao gồm 70% cám : 25% trấu : 5%. - oryzae với mật số 5.10 6 cfu/mL, điều kiện pH môi trường là 5, độ ẩm 60%, nhiệt độ ủ 45C trong thời gian 42 giờ. - Chế phẩm protease thể hiện hoạt tính cao nhất trong khoảng pH dung dịch đệm là 5 ÷ 5,5 với nhiệt độ 45 o C. - Chế phẩm protease cho hoạt tính cao nhất ở nồng độ casein là 0,8%. - Protease thể hiện khả năng thuỷ phân dung dịch acid protein tốt nhất ở thời gian là 50 phút với 1 mL dung dịch enzyme và nhiệt độ thuỷ phân là 45 o C.