- Nghiên cứu ñiều tra các chất ức chế proteinase ở các phần khác nhau của thân và hạt cây tô mộc (Caesalpinia sappan L.). - Công trình này nghiên cứu tác dụng của dịch chiết từ các phần khác nhau của thân, hạt cây tô mộc (C.sappan) ñến hoạt ñộ của một số proteinase. - Các kết quả nghiên cứu cho thấy:. - Dịch chiết từ phần vỏ cũng như phần gỗ thân cây C. - sappan ñều có hoạt tính ức chế trypsin (TIA) và hoạt tính ức chế chymotrypsin (ChIA). - TIA , ChIA của phần gỗ và lõi gỗ theo thứ tự vào khoảng 6,11 IU và 22,44 IU/100 gam nguyên liệu . - TIA , ChIA của phần vỏ thân theo thứ tự vào khoảng 52,45 IU và 74,94 IU/100 gam nguyên liệu. - Dịch chiết từ hạt C. - sappan có TIA, ChIA và chất ức chế poteinase của P.aeruginosa (PPsIA): TIA, ChIA của vỏ và nhân hạt không khác nhau nhiều, theo thứ tự, vào khoảng 3000 và hơn 10000 mIU/g. - Tuy nhiên, PPsIA của vỏ hạt cao hơn nhân hạt khoảng 5 lần, ñạt khoảng 1700mIU/g.. - Phổ ñiện di TI, ChI của dịch chiết nhân hạt C. - sappan tương tự nhau: có ít nhất 7 băng, tập trung ở 2 vùng, vùng thứ nhất có ñộ di ñộng ñiện di (Rm) tương ñương với các protein có Mr lớn hơn 43kD, vùng thứ 2 (có ít nhất 3 băng) tương ñương với các protein có Mr từ 20-30 kD và 1 băng vào khoảng 14 kD. - Sắc ký qua cột Sephadex G-75 hoặc G-100 nhận ñược một ñỉnh hoạt ñộng (ð2), ñạt hiệu suất hơn 90%, hoạt ñộ riêng tăng từ 3 – 4 lần.. - Cho ñến nay ñã có nhiều công trình nghiên cứu thành phần hóa học của gỗ cây C.. - sappan, nhưng chưa có công trình nào nghiên cứu các chất ức chế proteinase của cây này.. - Một số chất ức chế proteinase (PI) cũng có tác dụng kháng khuẩn, ngăn cản quá trình xâm. - Vì vậy, các PI cũng là ñối tượng ñã và ñang ñược nghiên cứu ñể phát triển thuốc [4], một số ñã ñược thương mại hóa [5]. - Nghiên cứu của chúng tôi về PI ñã bắt ñầu từ hơn 20 năm nay [6,7], ñã phát hiện và ứng dụng ñược một số PI quí như các PI của hạt gấc.. - C.sappan thuộc họ Caesalpiniaceae, hạt các cây họ này thường giàu PI nhưng cho ñến nay chưa tìm thấy các công bố về PI của C.sappan.. - Công trình này nghiên cứu tác dụng của dịch chiết từ các phần khác nhau của thân, hạt C.sappan ñến hoạt ñộ của trypsin, chymotrypsin, và proteinase tách từ Pseudomonas aeruginosa;. - nghiên cứu sự phân bố, ñiều kiện tách và tinh sạch sơ bộ các chất ức chế proteinase từ hạt của chúng. - Qủa và hạt C..sappan do Thạc sĩ Nguyễn thị Hòa, Trung tâm Trồng và chế biến cây thuốc, Viện Dược liệu Trung ương cung cấp. - Phương pháp. - Xác ñịnh hoạt ñộ ức chế trypsin (TIA), chymotrypsin (ChIA) theo phương pháp Anson cải tiến [9]. - Mỗi ñơn vị ức chế (IU) là lượng chất ức chế làm giảm 50% hoạt ñộ của 2mg enzyme.. - ðiện di phát hiện các băng chất ức chế:. - gel có cơ chất casein, sau khi ñiện di kết thúc, xử lý với enzyme tương ứng, ở vị trí có chất ức chế proteinase sẽ tạo thành các băng có mầu ñậm trên nền gel sáng hơn.. - Sắc ký qua cột Sephadex G-25 (cột có kích thước 1,1 x 55cm, cân bằng với dung dịch acetic acid 0,005M). - Sẹơadex G-75 (cột có kích thước 1,3 x 79 cm, cân bằng với dung dịch ñệm Sorensen 1/15M, pH 6,5. - Sephadex G- 100 (cột có kích thước 1,8 x 89cm, cân bằng với dung dịch ñệm Sorensen 1/15M, pH 6,5), rút protein cũng bằng các dung dịch cân bằng cột tương ứng.. - Kết quả và thảo luận. - ðể lựa chọn dung dịch chiết rút TI và ChI , ñã sử dụng các loại dung dịch sau: dung dịch ñệm Sorensen M/15 pH 6,5, dung dịch ethanol 50% và dung dịch NaCl 0,9%.. - Hàm lượng protein, TIA, ChIA của thân C. - sappan khi sử dụng các loại dung dịch khác nhau ñể chiết rút. - Mẫu Dung dịch. - Protein, TIA, ChIA của mỗi phần tính trên 100g thân (theo tỉ lệ % trọng lượng của mỗi phần so với toàn thân (100g thân có 39,5 g vỏ mềm. - Dung dịch dùng ñể chiết rút. - Kết quả trên bảng 1 cho thấy TIA và ChIA trong dịch chiết ethanol 50% của V, G cũng như L luôn cao hơn ở các dịch chiết khác. - Từ số liệu ở bảng 1 có thể tính ñược dịch chiết ethanol của 100g vỏ thân có TIA , ChIA theo thứ tự vào khoảng 52,45 IU và 74,94 IU. - TIA, ChIA của phần gỗ thấp nhất, nếu tính tổng TIA, ChIA của cả gỗ và lõi, theo thứ tự vào khoảng 6,11 IU và 22,44 IU/100gam, thấp hơn các giá trị tương ứng của vỏ mềm khoảng 8,5 và hơn 3 lần. - Kết quả này cũng cho thấy: ChIA luôn cao hơn TIA, giống như kết qủa nghiên cứu trước ñây của chúng tôi ñối với nhiều cây thuốc khác [12].. - Dựa vào tỉ lệ trọng lượng của mỗi phần V, G, L so với trọng lượng toàn thân ñể tính protein, TIA, ChIA có trong 100 g thân, cũng cho thấy: protein, TIA và ChIA trong DC ethanol của phần vỏ thân (V) vẫn cao hơn các phần khác, mặc dù nó chỉ chiếm 39,5% trọng lượng của thân (bảng 2, hình 1). - Do ñó, TIA, ChIA của phần vỏ luôn chiếm tỉ lệ % khá cao của tổng TIA hoặc ChIA của thân, trong dịch chiết ethanol hoặc NaCl có thể chiếm ñến hơn 80% (hình 2). - TIA (a), ChIA (b), Protein (c) tính theo % của tổng protein hoặc TIA hoặc ChIA của toàn thân. - khi chiết bằng các dung dịch khác nhau.. - Hoạt ñộ ức chế proteinase (PIA) của vỏ và nhân hạt chín.. - Các kết quả nghiên cứu trước ñây của chúng tôi ở hạt các cây họ bí [6] cho thấy hạt càng già TIA càng cao, ngay cả ở giai ñoạn mất nước (desiccation), vì vậy, chúng tôi cũng ñã. - nghiên cứu và lựa chọn ñược hạt ở giai ñoạn có PIA cao, gọi là hạt chín. - Sự phân bố TIA ở các phần của hạt cũng không ñồng ñều, vì vậy chúng tôi ñã tách riêng vỏ hạt, nhân hạt chín và xác ñịnh hoạt ñộ ức chế proteinase (PIA) ở mỗi phần.. - Hàm lượng protein, hoạt ñộ ức chế proteinase (PIA) của vỏ và nhân hạt C.sappan chín. - Vỏ hạt Nhân hạt. - Kết quả ở bảng 3 cho thấy TIA và ChIA của vỏ và nhân hạt cao hơn TIA, ChIA của vỏ thân khoảng 5 ñến 14 lần. - So sánh giữa vỏ và nhân hạt, ta thấy TIA và ChIA khác nhau không nhiều, nhưng hoạt ñộ ức chế proteinase Pseudomonas aeruginosa (PPsIA) của DC vỏ hạt cao gấp hơn 5 lần PPsIA của DC nhân hạt.. - Thử hoạt tính kháng khuẩn (hình 3) cho thấy DC vỏ hạt có tác dụng ức chế sinh trưởng. - Tuy nhiên khi ñiện di DC vỏ hạt ñã không phát hiện ñược băng protein hoặc băng PI nào. - Có thể PIA của DC vỏ chủ yếu là do những chất phân tử thấp, không phải protein? Vấn ñề này ñang ñược tiếp tục nghiên cứu. - Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết vỏ hạt (a): S. - Thăm dò ñiều kiện chiết rút các chất ức chế trypsin (TI), ức chế chymotrypsin (ChI) từ hạt C. - ðể lựa chon dung dịch thích hợp chiết rút các chất ức chế chúng tôi ñã sử dụng 4 dung dịch thường dùng là: nước Mili Q, ñệm Sorensen 1/15M pH 6,5, dung dịch acetic acid 0,005M, dung dịch ñệm natri acetate 0,02M pH 4,5.. - Kết quả xác ñịnh cho thấy TIA trong dịch chiết (DC) bằng ñệm Sorensen pH 6,5 cao hơn các dịch chiết khác, gấp gần 2 lần TIA trong DC pH axit. - Tính hoạt ñộ riêng của TIA, ChIA cũng cho kết quả tương tự.. - Phổ ñiện di protein, TI, ChI của 4 loại DC ðể so sánh kỹ hơn khả năng chiết rút các PI, chúng tôi ñã sử dụng phương pháp ñiện di trên gel polyacrylamid (PAGE).Kết quả ñiện di protein (hình 4a) cho thấy phổ ñiện di protein của các DC khá tương tự nhau về số băng protein có khối lượng phân tử thấp. - (di ñộng chậm) có nhiều hơn so với 2 dung dịch còn lại. - Sử dụng phương pháp PAGE ñồng trùng hợp với cơ chất casein 0,1% là phương pháp nhạy, cho phép phát hiện trực tiếp một cách ñầy ñủ các TI/ChI từ một lượng rất ít dịch chiết thô (<20 microlit) mà không cần phải tinh sạch, thích hợp cho việc ñiều tra, so sánh “bộ” PI của mẫu. - Kết quả cho thấy: phổ TI và ChI của 4 loại dịch chiết ñều tương tự như nhau, có ít nhất 7 băng, ñược ñánh số từ 1–7 theo ñộ di ñộng ñiện di tăng dần (hình 4b). - Các băng TI/ChI 1,2,3 khá rõ nét nhưng các băng protein tương ứng lại mờ nhạt (nhất là ở cột 3 và 4), chứng tỏ các protein có hoạt tính ức chế này chỉ chiếm tỉ lệ thấp trong tổng protein của DC.. - Các kết quả nhận ñược cho thấy ñể chiết rút ñược nhiều TI và ChI nên sử dụng dung dịch ñệm Sorensen 1/15M pH 6,5.. - Phổ ñiện di protein (a), ChIA/TIA (b) hạt Cp trong các dung dịch chiết khác nhau.. - Dung dịch ñệm Sorensen 1/15M pH 6,5 3. - Dung dịch acetic acid 0,005M 4. - Dung dịch ñệm natri acetate 0,02M pH 4,5.. - sappan bằng phương pháp sắc ký qua cột Sephadex. - Sắc ký qua cột Sephadex - G25 (a), Sephadex -G75 (b. - Kết quả trên hình 5 cho thấy khi sắc ký DC nhân hạt qua các cột Sephadex ñều nhận ñược 2 ñỉnh protein, nhưng với cột Sephadex G-25 cả 2 ñỉnh ñều có TIA, ChIA, nhưng hiệu suất thu hồi thấp (bảng 4). - Sắc ký ñồ qua cột Sephadex G- 75 và G-100 khá giống nhau: TIA, ChIA tập trung vào ñỉnh protein thứ 2 (ð2), hiệu suất. - Từ bảng tóm tắt kết quả sắc ký qua các cột Sephadex khác nhau (bảng 4) cho thấy ñể tinh sạch sơ bộ các TI,ChI từ hạt C.. - sappan có thể sử dụng cột Sephadex G-75 hoặc G-100. - ðỉnh 2 thu ñược từ các cột này ñang ñược nghiên cứu tiếp.. - Tóm tắt kết quả sắc ký qua các cột Sephadex khác nhau TIA ChIA Mẫu: sau khi sắc. - ký qua cột Sephadex Hiệusuất. - Phổ ñiện di protein, TI/ChI của ñỉnh ð2 của cột Sephadex G-75 và G-100 cũng tương tự nhau (hình 6). - Kết quả này giống với kết quả nhận ñược khi ñiện di ñỉnh 1 và ñỉnh 2 của cột Sephadex G-25 (hình 7). - Phổ ñiện di các ñỉnh protein nhận ñược sau khi sắc ký DC hạt C. - qua cột Sephadex G-75/G100 (1. - (d): ức chế PA của P. - Phổ ñiện di của mẫu hạt C.sappan trước và sau khi qua cột Sephadex G-25.. - (c): chất ức chế PA của P. - 1) Dịch chiết từ phần vỏ cũng như phần gỗ thân cây C. - Sử dụng dung dịch ethanol 50% ñể chiết rút các chất ức chế ñạt ñược hoạt ñộ cao nhất: TIA , ChIA của phần gỗ và lõi gỗ theo thứ tự vào khoảng 6,11 IU và 22,44 IU/100 gam nguyên liệu . - TIA , ChIA của phần vỏ theo thứ tự vào khoảng 52,45 IU và 74,94 IU/100 gam nguyên liệu. - Dịch chiết vỏ hạt có tác dụng ức chế sinh trưởng S. - 2) Dịch chiết từ hạt C. - sappan có TIA, ChIA và chất ức chế poteinase của P.aeruginosa (PPsIA). - PPsIA của vỏ hạt ñạt khoảng 1700mIU/g, cao hơn nhân hạt khoảng 5 lần. - tuy nhiên TIA, ChIA của chúng lại không khác nhau nhiều, theo thứ tự, vào khoảng 3000 và hơn 10000 mIU/ g.. - 3) Phổ ñiện di TI, ChI của dịch chiết hạt C.. - sappan tương tự nhau: có ít nhất 7 băng, tập trung ở 2 vùng, vùng thứ nhất có ñộ di ñộng ñiện di (Rm) tương ñương với các protein có Mr lớn hơn 43kD, vùng thứ 2 (có ít nhất 3 băng) tương ñương với các protein có Mr từ 20-. - 4) Sắc ký qua cột Sephadex G-75 hoặc G- 100 nhận ñược một ñỉnh hoạt ñộng (ð2) ñạt hiệu suất hơn 90%, hoạt ñộ riêng tăng từ 3 – 4 lần. - [12] Phạm Thị Trân Châu, Hoàng Thu Hà, Nguyễn thị Hòa, Phạm Hồng Minh, Proteinase và hoạt ñộ ức chế proteinase của một số cây thuốc chữa bệnh mụn nhọt - mẫn ngứa - lở loét - bệnh da, Tạp chí Dược liệu . - sappan dormant seeds extract possesses TIA, ChIA as well as inhibitors against P