- PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH NẤM MEN TRONG LÊN MEN RƯỢU VANG DÂU HẠ CHÂU (Baccaurea ramiflora L.) Nguyễn Văn Vũ 1 và Nguyễn Văn Thành 2*. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn nấm men có hoạt tính lên men cao từ quả dâu, từ đó ứng dụng lên men rượu vang dâu Hạ Châu chất lượng cao (hàm lượng rượu cao, rượu tạp và aldehyde thấp, cảm quan tốt). - Kết quả nghiên cứu đã được phân lập được 48 dòng nấm men từ dịch quả dâu tại thành phố Cần Thơ và tỉnh Hậu Giang. - Dựa vào khóa phân loại nấm men (hình thái, sinh lý, sinh hóa) ba giống được phân lập gồm:. - Thí nghiệm thực hiện trên các dòng thuộc giống Sacharomyces và đã tuyển chọn dòng nấm men CB1.1. - Rượu vang dâu Hạ Châu lên men từ nấm men CB1.1 với dịch phối chế từ các thông số tối ưu Brix = 24,70, pH = 4,20, mật số tế bào nấm men 10 7 tế bào/mL và lên men ở nhiệt độ phòng trong 10 ngày cho kết quả độ rượu tối ưu 13,76%. - Kết quả định danh dòng nấm men CB1.1 bằng phương pháp giải trình tự DNA đã xác định được CB1.1 tương đồng với Saccharomyces cerevisiae.. - Phân lập, tuyển chọn và định danh nấm men trong lên men rượu vang dâu Hạ Châu (Baccaurea ramiflora L. - Một trong những phương pháp cải tiến chất lượng là sử dụng nguồn nấm men tự nhiên được. - Mẫu dâu phân lập nấm men gồm: dâu bòn bon (Hình 1a), dâu Gia Bảo (Hình 1b), dâu Xiêm (Hình 1c), dâu Hạ Châu (Hình 1d) được thu tại vườn ở Cần Thơ và Hậu Giang.. - Nấm men đối chứng Saccharomyces cerevisiae (Hoa Kỳ)- kí hiệu ĐC, được lưu giữ ở 4 o C tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.. - 2.2.1 Phân lập và tách ròng nấm men tự nhiên từ dịch quả dâu lên men (4 loại dâu). - 2.2.2 Tuyển chọn nấm men có hoạt lực lên men cao từ các dòng nấm men phân lập. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm so sánh khả năng lên men và chọn ra dòng nấm men có hoạt lực lên men mạnh nhất để lên men rượu dâu Hạ Châu.. - Nuôi cấy tế bào nấm men trong môi trường tăng sinh khối đến khi mật số tế bào nấm men đạt 10 6 tế bào/mL dịch lên men. - Cho vào bình tam giác 1 mL dịch nấm men + 99 mL dịch quả phối chế (nước ép dâu Hạ Châu điều chỉnh pH = 4,0. - Tuyển chọn được dòng nấm men có hoạt lực lên men tốt nhất dựa vào thời gian lên men nhanh nhất và cho độ rượu cao nhất.. - Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các nhân tố chính: mật số nấm men (MSNM), độ Brix, pH đến quá trình lên men rượu vang dâu Hạ Châu nhằm tìm ra nghiệm thức/tổ hợp thích hợp nhất cho lên men rượu vang dâu Hạ Châu.. - Mật số nấm men (tế bào/mL C 1 , C 2 , C 3. - 2.2.4 Định danh nấm men bằng phương pháp giải trình tự gen. - 3.1 Phân lập và định danh sơ bộ các dòng nấm men từ quả dâu lên men. - Theo Nguyễn Đức Lượng (2003), có thể định danh sơ bộ các dòng nấm men dựa vào đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý sinh hóa của nấm men. - Đặc điểm sinh lý sinh hóa bao gồm: khả năng lên men đường glucose, sucrose và khả năng phân giải urea của nấm men.. - 3.1.1 Đặc điểm hình thái của 48 dòng nấm men phân lập được. - Bảng 1: Số lượng và hình dạng nấm men được phân lập ở thành phố Cần Thơ và tỉnh Hậu Giang Địa. - Nấm men có thể thay đổi hình dạng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh.. - Kết quả phân lập được 48 dòng nấm men từ nguồn quả dâu ban đầu. - Dựa vào hình dạng tế bào, 48 dòng nấm men phân lập có thể được xếp thành 7 nhóm thể hiện ở Bảng 1 và Hình 2.. - Các dòng nấm men phân lập được ký hiệu như sau: chữ cái đầu tiên C (Cần Thơ) và H (Hậu. - chữ số thứ 4 là thứ tự số lượng dòng nấm men cho mỗi địa điểm tương ứng mỗi loại dâu. - Dòng nấm men phân lập cụ thể được kí hiệu mã hóa cho 3 kí tự chữ và số đầu tiên thể hiện ở Bảng 2.. - Bảng 2: Mô tả kí hiệu các dòng nấm men phân lập ở thành phố Cần Thơ và tỉnh Hậu Giang. - 3.1.2 Đặc điểm nảy chồi của 48 dòng nấm men phân lập. - Theo Lương Đức Phẩm (2009), nảy chồi là hình thức sinh sản vô tính điển hình của nấm men.. - Hình 2: Hình dạng tế bào của 7 dòng nấm men tiêu biểu của 7 nhóm. - Hình 3: Đặc điểm nảy chồi của 7 nhóm nấm men phân lập được Nảy chồi nhiều hướng: (a), (b), (c), (d). - nấm men phân lập. - Theo Lương Đức Phẩm (2009), khả năng tạo bào tử và hình dạng của bào tử là dấu hiệu loài của nấm men. - Nấm men chỉ hình thành bào tử trong. - Kết quả hình thành bào tử của các dòng nấm men phân lập được trong môi trường thạch nước cho thấy sau 6 tuần nuôi cấy ở nhiệt độ 30 o C, có 6 nhóm nấm men hình thành bào tử và 1 nhóm nấm men không hình thành bào tử được mô tả ở Hình 4 và Bảng 3.. - Hình 4: Đặc điểm hình thành bào tử của 7 nhóm nấm men phân lập được Hình thành bào tử: (a), (b), (c), (d), (e) và (f). - sucrose trong chuông Durham và phân giải urê của 48 dòng nấm men trên. - Khả năng lên men các loại đường là một trong những chỉ tiêu quan trọng được sử dụng để phân loại nấm men. - Khả năng lên men đường của 48 dòng nấm men phân lập được nuôi cấy trên các loại đường glucose và sucrose (2%) trong ống nghiệm 10 mL có chuông Durham (theo phương pháp của. - Sự thay đổi màu sắc của môi trường Christensen khi nuôi cấy nấm men phân lập sau thời gian ủ 7 ngày thể hiện hoạt tính phân giải urea của các dòng nấm men được thể hiện qua Hình 5.. - (1972), nếu nấm men có khả năng sinh enzyme urease để phân giải urea, môi trường. - Khi nấm men có enzyme urease để phân giải urea. - (a) (b) (a) (b) Hình 5: Test urease các dòng nấm men trên môi trường. - ống nghiệm 2-8: có chủng nấm men nhưng không phản ứng (không chuyển màu đỏ sẫm);. - Hình 6: Khả năng lên men đường glucose và sucrose của các dòng nấm men (a) lên men đường glucose (ống nghiệm 1, 2, 3 đều lên men làm chuông Durham bị đẩy lên);. - Kết quả có 5 nhóm tế bào nấm men (hình cầu lớn, cầu nhỏ, oval lớn, oval nhỏ, elip nhọn) đều có các dòng nấm men không có khả năng phân giải urea. - Riêng dòng nấm men có hình elip dài (CB1.2, CB2.1, CD2.2, CD2.3, CX2.3, HB2.1, HD2.2, HX2.1) và nhóm tế bào nấm men có hình elip ngắn. - Tổng hợp kết quả từ khóa phân loại có thể xếp các dòng nấm men thuộc 7 nhóm này thuộc các giống như sau:. - Bảng 3: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại của các dòng nấm men đã phân lập. - Dòng nấm men. - nấm men Tế bào nảy chồi. - Các dòng nấm men thuộc nhóm tế bào nấm men có hình cầu lớn, cầu nhỏ, oval lớn, oval nhỏ có đặc điểm giống như mô tả nên có thể kết luận rằng các dòng nấm men trên là giống Saccharomyces.. - Dòng nấm men CD1.4 và HD2.3 tế bào có hình elip nhọn, sinh dưỡng nảy chồi lưỡng cực, 1 – 2 bào tử, có khả năng lên men đường glucose và không phân giải urea. - Như vậy, có thể kết luận dòng nấm men trên là giống Hanseniaspora.. - Như vậy, có thể kết luận các dòng nấm men thuộc nhóm có hình elip dài và elip ngắn là giống Pichia do sinh dưỡng nảy chồi lưỡng cực, hình thành bào tử với 1 – 2 bào tử hình tròn, lên men yếu hoặc không có khả năng lên men đường glucose, đồng thời không có khả năng sinh enzyme urease.. - Như vậy, 48 dòng nấm men phân lập ở 4 địa điểm: huyện Phong Điền (Cần Thơ), quận Bình Thủy (Cần Thơ), huyện Châu Thành A (Hậu Giang) và huyện Châu Thành (Hậu Giang) thuộc 3 giống nấm men là Saccharomyces, Hanseniaspora và Pichia.. - 3.2 Hoạt tính lên men của các dòng nấm men phân lập thuộc giống Sacharomyces. - Ba mươi ba dòng nấm men thuộc giống Saccharomyces được chọn để tiến hành khảo sát và so sánh với khả năng lên men với dòng nấm men đối chứng. - 3.2.1 Hoạt tính lên men dịch quả của các dòng nấm men phân lập trong chuông Durham. - Chiều cao cột khí CO 2 trong chuông Durham thể hiện cường độ lên men của các dòng nấm men ở từng thời điểm lên men khác nhau. - men giữa các dòng nấm men. - Ba dòng nấm men CB1.1, CC2.2 và CX1.3 đều lên men nhanh nhất (làm đầy cột khí trong 3 giờ). - 3.2.2 Hoạt tính lên men dịch quả của các dòng nấm men phân lập trong bình tam giác. - Thí nghiệm khảo sát khả năng lên men được tiến hành với mật số nấm men 10 6 tế bào/mL, thời gian ủ là 10 ngày ở 30 o C. - Bảng 4: Các chỉ tiêu pH, độ Brix và độ rượu sau lên men của 19 dòng nấm men. - STT Dòng nấm men pH Độ Brix. - Kết quả ở Bảng 4 cho thấy dòng nấm men CB1.1 có khả năng lên men cho độ rượu cao nhất (12,71% v/v) và độ Brix giảm thấp (7,83 o Brix), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% so với các dòng nấm men đã phân lập còn lại và có độ rượu cao hơn độ rượu thu được của dòng nấm men đối chứng (7,9% v/v). - Mặt khác, CB1.1 cũng là dòng nấm men lên men nhanh nhất trong chuông Durham.. - Hình 7: Hình dạng tế bào (a) và khuẩn lạc (b) của dòng nấm men CB1.1 (Hình vật kính 100X) Theo Lương Đức Phẩm (2009), độ Brix biểu thị. - Sự biến đổi của hàm lượng đường trong quá trình lên men là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá khả năng lên men của các dòng nấm men. - Trong quá trình lên men, nấm men sử dụng đường trong điều kiện kỵ khí tạo thành rượu etylic. - Độ rượu là một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá khả năng lên men rượu của nấm men. - Vì thế, độ rượu càng cao và hàm lượng đường sót lại thấp sau khi lên men thể hiện năng lực chuyển hóa đường thành rượu và hiệu suất lên men rượu của nấm men cao. - Do đó, dòng nấm men CB1.1 được chọn là dòng nấm men tốt nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo và cũng sẽ được định danh bằng phương pháp giải trình tự.. - 3.3 Ảnh hưởng của các nhân tố pH, độ Brix, mật số nấm men ban đầu đến quá trình lên men rượu vang dâu Hạ Châu. - 4,5), độ Brix và mật số nấm men tế bào/mL) để tìm ra nghiệm thức tốt nhất. - Sau 10 ngày lên men, kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của pH, độ Brix và mật số nấm men đến khả năng lên men rượu vang dâu Hạ Châu được trình bày ở Bảng 5.. - Bên cạnh đó, khi quan sát về sự tác động của mật số nấm men lên quá trình lên men rượu, những nghiệm thức có mật số nấm men 10 3 tế bào/mL lên men không tốt bằng những nghiệm thức có mật số. - nấm men 10 5 tế bào/mL và nghiệm thức có mật số nấm men 10 7 tế bào/mL.. - Theo Nguyễn Công Hà (2000), nấm men phát triển tốt ở pH từ 3,8 đến 4,0. - Nguyên nhân là do sự hoạt động của nấm men trong quá trình lên men kỵ khí sinh ra CO 2 và một số acid hữu cơ làm giảm pH của dịch phối chế ban đầu (Lương Đức Phẩm, 2009). - Như vậy, pH ở các nghiệm thức mặc dù giảm vẫn phù hợp cho nấm men phát triển.. - Theo Lương Đức Phẩm (2009), độ rượu là chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá khả năng lên men rượu của nấm men. - thông số pH, độ Brix, và mật số nấm men tối ưu đã. - Bảng 5: Giá trị pH, độ Brix và độ rượu trung bình sau lên men của dòng nấm men CB1.1 Nghiệm. - 0 Brix và Z là mật số nấm men). - Kết quả phân tích thống kê cho thấy mật số nấm men tế bào/mL) khác biệt không ý nghĩa, vì vậy cố định Z. - Chọn mật số nấm men chủng vào ban đầu là 10 7 tế bào/mL vì mật số nấm. - Dòng nấm men CB1.1 được định danh bằng phương pháp giải trình tự và phân tích trình tự gen 28S rRNA. - Kết quả giải trình tự trên đoạn gen 28S rRNA của dòng nấm men CB1.1 như sau:. - Kết quả nhận được cho thấy đoạn gen 28S rRNA của dòng nấm men CB1.1 có độ tương đồng đến 99% so với trình tự gen 28S rRNA của Saccharomyces cerevisiae (KF728798.1) (Hình 10).. - Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 48 dòng nấm men từ quả dâu thu tại vườn ở thành phố Cần Thơ (huyện Phong Điền và quận Bình Thủy) và tỉnh Hậu Giang (huyện Châu Thành và huyện Châu Thành A). - Dòng nấm men CB1.1 phân lập từ dịch dâu bòn bon (Phong Điền - Cần Thơ) lên men tự nhiên (được tuyển chọn từ 33 dòng nấm men phân lập thuộc giống Saccharomyces) là dòng nấm men có hoạt lực lên men cao nhất (độ rượu đạt được 13,66% v/v). - Nấm men công nghiệp.. - Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên lên men rượu vang mít lá bàng tại tỉnh An Giang