Phân lập và nhận diện vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA trong cây đậu phộng (lạc) (Arachis hypogaea L.) trồng tại 03 huyện miền núi tỉnh Bình Định

- PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN LÂN VÀ TỔNG HỢP IAA TRONG CÂY ĐẬU PHỘNG (LẠC) (Arachis hypogaea L.) TRỒNG TẠI 03 HUYỆN MIỀN NÚI TỈNH BÌNH ĐỊNH.
- 3 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
- Cố định đạm, đậu phộng, hòa tan lân, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh.
- Một trăm chín mươi mốt dòng vi khuẩn được phân lập từ 93 mẫu nốt sần, rễ, thân cây đậu phộng (lạc) trồng tại 03 huyện miền núi tỉnh Bình Định (Vân Canh, Vĩnh Thạnh, An Lão).
- Các dòng vi khuẩn phân lập được đều tạo màng mỏng (pellicle), đều có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA.
- Trong nghiên cứu, 15 dòng vi khuẩn có đặc tính tốt được tuyển chọn để nhận diện bằng kỹ thuật PCR.
- Kết quả cho thấy 15 dòng này đều là vi khuẩn nội sinh.
- Các dòng vi khuẩn được nhận diện thuộc 6 chi, bao gồm chi Acinetobacter (5 dòng), chi Bacillus (4 dòng), chi Burkholderia (2 dòng), chi Klebsiella (2 dòng), chi Enterobacter (1 dòng) và chi Sphingomonas (1 dòng) với tỷ lệ tương đồng DNA từ 98-99%..
- Bên cạnh vi khuẩn nốt sần,.
- nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy bên trong hệ thống mô của cây đậu phộng có chứa hệ vi khuẩn nội sinh.
- Vi khuẩn nội sinh đã được chứng minh giúp tăng cường sự sinh trưởng của cây trồng (Barbieri et al., 1986), thúc đẩy các quá trình chuyển hóa, kích thích phát triển lông rễ (Harari et al., 1988), tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng nhiều nguồn bệnh (Bandara et al., 2006;.
- Fahey et al., 1991), giúp cố định đạm sinh học, giảm tính mẫn cảm với mầm bệnh và sự thay đổi của thời tiết gây tổn hại cho cây (Xu et al., 1998) và hòa tan lân khó tan (Lăng Ngọc Dậu và ctv., 2007)..
- Những năm qua, nghiên cứu liên quan đến cây đậu phộng tại tỉnh thường tập trung vào các hướng như nghiên cứu chọn lọc giống đậu phộng, nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật trồng cây đậu phộng, nghiên cứu mô hình xen canh đậu phộng với các loại cây trồng khác.
- Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA đã được nghiên cứu nhiều ở trong và ngoài nước, tuy nhiên tại tỉnh Bình Định thì chưa có nghiên cứu nào được tiến hành.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp nguồn giống vi khuẩn bản địa có đặc tính tốt về khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA để ứng dụng cho việc nghiên cứu và sản xuất phân vi sinh dùng trong sản xuất cây đậu phộng trồng tại tỉnh Bình Định và là nguồn tài liệu, thông tin mới bổ sung vào cơ sở dữ liệu về lĩnh vực nông học tỉnh Bình Định..
- Để tiến tới một nền nông nghiệp bền vững, đậu phộng trồng tại tỉnh Bình Định cần được nghiên cứu về những vi khuẩn nội sinh, xác định và đánh giá một số đặc tính tốt như cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như IAA để ứng dụng những vi khuẩn nội sinh tốt cho cây trồng nói chung và cây đậu phộng nói riêng.
- Ba huyện miền núi của tỉnh Bình Định đã được lựa chọn làm địa điểm nghiên cứu phân tích tính đa dạng, mối quan hệ của các chủng vi sinh vật nội sinh đã phân lập và khảo sát hoạt tính..
- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
- Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn.
- Nước rửa lần thứ 4 được hút 100 100 µL và chủng trên các đĩa chứa môi trường TYGA (tryptone – yeast extract – glucose – agar), ủ ở 30 o C.
- Sau 24 - 48 giờ quan sát, nếu thấy trên các đĩa môi trường này không xuất hiện khuẩn lạc thì mẫu đã đạt yêu cầu khử trùng..
- Phân lập các dòng vi khuẩn.
- Vi khuẩn nội sinh của thân và rễ cây đậu phộng được phân lập trên môi trường PDA (potato - dextrose - agar).
- Vi khuẩn nội sinh của nốt rễ được phân lập trên môi trường G 6 (G 6 là môi trường YEMA (yeast - extract – manitol – agar) được thay thế manitol thành glycerol.
- Đây là môi trường được sử dụng để phân lập vi khuẩn nội sinh và phân lập cả vi khuẩn nốt sần).
- Mẫu được khuấy đều và hút 100 µL dịch trích cho vào các ống nghiệm chứa môi trường bán đặc (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần).
- Các ống nghiệm được quan sát nếu thấy có một lớp màng mỏng (pellicle) gần bề mặt môi trường thì chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh.
- Kim cấy đã khử trùng được dùng đâm xuyên qua màng pellicle và cấy vào đĩa môi trường đặc tương ứng, ủ ở 30 o C..
- Sau 24 – 48 giờ, các khuẩn lạc khác nhau mọc trên bề mặt môi trường được tiếp tục cấy chuyền sang các đĩa môi trường tương ứng vài lần đến khi các khuẩn lạc xuất hiện trên đường cấy rời nhau và hình thái khuẩn lạc thuần nhất.
- Khi thấy vi khuẩn đã thật sự ròng (thuần nhất) thì cấy chuyển sang ống nghiệm chứa môi.
- Khảo sát đặc tính cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA.
- Vi khuẩn được nuôi trong môi trường Burk’s không đạm, lỏng (Park et al., 2005), đặt ở nhiệt độ phòng và lắc với tốc độ 120 vòng/phút.
- Định lượng lân hòa tan.
- Vi khuẩn được nuôi trong môi trường NBRIP lỏng (Nautiyal, 1999), đặt ở nhiệt độ phòng và lắc với tốc độ 120 vòng/phút.
- Thực hiện định lượng lân hòa tan bằng thuốc thử acid ascorbic - ammoniummolypdate - potassium antinomol tartrate theo nguyên tắc lân sau khi được hòa tan trong môi trường sẽ tác dụng với ammoniummolybdate trong môi trường acid tạo hợp chất phosphomolybdate màu vàng.
- Phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 880 nm ở các ngày 5, 10, 15 và 20 ngày nuôi được sử dụng để kiểm tra hàm lượng lân được hòa tan..
- Vi khuẩn được nuôi trong môi trường phân lập lỏng có bổ sung 100 mg/L tryptophan, đặt ở nhiệt độ phòng và lắc với tốc độ 120 vòng/phút và định lượng bằng thuốc thử Salkowski R2 và phương pháp so màu ở bước sóng 530 nm vào các thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày nuôi..
- Nhận diện các dòng vi khuẩn 2.3.1.
- Quy trình tách chiết DNA vi khuẩn được thực hiện theo Nguyễn Thị Thu Hà và ctv.
- Để nhận diện vi khuẩn sống nội sinh, sử dụng các đoạn mồi 16sRNA được thiết kế theo Zinniel et al.
- Giải trình tự DNA.
- Sử dụng đoạn mồi 1 p515FPL (5’- GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3’) trong phản ứng PCR để nhận diện vi khuẩn nội sinh đã mô tả ở phần trên.
- Sử dụng chương trình BLAST N và BioEdit để so sánh trình tự các đoạn DNA của 3 dòng vi khuẩn với trình tự DNA của bộ gen ở các loài vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI)..
- Kỹ thuật PCR và giải trình tự DNA được dùng để nhận diện vi khuẩn nội sinh.
- Sau khi được định danh, dựa trên kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trước đây về khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA của từng dòng vi khuẩn kết hợp với kết quả khảo sát in vitro của nghiên cứu này để tuyển chọn những dòng vi khuẩn cho thí nghiệm khảo sát tại nhà lưới..
- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.
- Phân lập vi khuẩn nội sinh.
- Từ 93 mẫu (31 mẫu thân, 31 mẫu rễ và 31 mẫu nốt sần), 191 dòng được thu, trong đó có 134 dòng phân lập trên môi trường PDA, 57 dòng phân lập trên môi trường G 6 .
- 58 dòng phân lập từ rễ chiếm phân lập từ thân chiếm 39,79% và 57 phân lập từ nốt rễ chiếm 29,84% (Bảng 1)..
- Bảng 1: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn trên hai môi trường PDA và G 6.
- Môi trường.
- phân lập Nguồn.
- Các dòng vi khuẩn phân lập được đều có chung một đặc tính là sinh trưởng và phát triển ở điều kiện vi hiếu khí trong các môi trường bán đặc, chúng phát triển thành lớp màng mỏng cách mặt môi trường nuôi khoảng 2 – 5 mm.
- (1999), theo nghiên cứu của Perin et al.
- (2006) thì lớp màng mỏng hình thành cách mặt môi trường là 4 mm, kết quả của Santos et al.
- (2009) thì lớp màng cách mặt môi trường từ 0,5 – 1 cm.
- Lớp màng mỏng hình thành trong môi trường bán đặc này có màu hơi trắng hoặc hơi vàng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Santos et al.
- Bảng 1 cho thấy các dòng vi khuẩn nội sinh phân bố đều trong các bộ phận thân, rễ, nốt rễ của cây.
- Số lượng dòng vi khuẩn được phân lập trung bình là hai dòng trên một mẫu..
- Một số đặc tính của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được.
- Khả năng cố định đạm.
- Tất cả 191 dòng vi khuẩn được khảo sát đều có khả năng tạo NH 4 + cấy trên môi trường Burk đặc (agar) không đạm.
- Hàm lượng đạm sinh ra được đo vào ngày thứ sau nuôi cấy, trong đó dòng GN49a cố định đạm cao nhất với hàm lượng trung bình là 2,25 mg/L..
- Khả năng hòa tan lân khó tan.
- Tất cả 191 dòng vi khuẩn được khảo sát đều có khả năng hòa tan lân khó tan trong môi trường NBRIP.
- Lượng lân hòa tan được đo vào các ngày sau nuôi cấy, dòng GN54b hòa tan được nhiều lân nhất với hàm lượng trung bình là 367,34 mg/L..
- Khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA).
- Tất cả 191 dòng vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường phân lập tương ứng có bổ sung 100 mg/L tryptophan được khảo sát đều có khả năng tổng hợp IAA.
- Lượng IAA tổng hợp được đo vào các ngày sau nuôi cấy, dòng PR49a có khả năng tổng hợp IAA cao nhất với hàm lượng trung bình là 5,54 µg/L..
- Kết quả khảo sát của nghiên cứu cho thấy 191 dòng đều có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA.
- Từ kết quả khảo sát, nhóm nghiên cứu đã chọn ra 15 dòng có đặc tính tốt (Bảng 2) để tiến hành nhận diện bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự DNA..
- Các dòng vi khuẩn có đặc tính tốt về cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA Stt Dòng vi.
- Lượng đạm cố định.
- trung bình (mg/L) Lượng lân hòa tan.
- Mười lăm dòng vi khuẩn trên được chọn từ 3 huyện, mỗi huyện chọn 5 dòng với tiêu chí tuyển chọn là dòng có khả năng cố định đạm cao nhất, dòng có khả năng hòa tan lân cao nhất và dòng có khả năng tổng hợp IAA cao nhất đều được chọn, bên cạnh đó dòng có hai đặc tính tốt (cố đính đạm và hòa tan lân đều cao hoặc cố định đạm và tổng hợp IAA đều cao) sẽ được chọn.
- Bảng 2 cho thấy 15 dòng vi khuẩn nội sinh được chọn lọc đều có khả năng cố định đạm với hàm lượng từ 0,08 đến 2,25 mg/L, hòa.
- tan lân với hàm lượng từ 94,10 đến 360,56 mg/L và tổng hợp IAA với hàm lượng 0,11 đến 5,54 µg/L..
- Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR.
- Khi phân tích PCR với 3 đoạn mồi 16S rDNA (p515FPL, p-13B và PCR-1) để nhận diện các dòng vi khuẩn đã chọn lọc đều là vi khuẩn nội sinh, 15/15 dòng cho băng DNA ở vị trí khoảng 900 bp so với thang chuẩn (Hình 1a, 1b, 1c), phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây của Zinniel et al.
- Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi khuẩn nội sinh trên gel agarose 1,5%.
- Kết quả giải trình tự DNA của một số dòng vi khuẩn.
- Sản phẩm PCR (với cặp mồi p515FPL – P13B – PCR1) của 15 dòng vi khuẩn được sử dụng để giải trình tự DNA và sử dụng phần mềm Blast N để so sánh với trình tự DNA của các dòng vi khuẩn có.
- Kết quả cho thấy trình tự các dòng vi khuẩn có độ tương đồng với trình tự gen của dòng vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu rất cao 98-99% và các dòng vi khuẩn tương đồng đều là các chi thuộc vi khuẩn nội sinh (Bảng 3)..
- Tổng hợp kết quả so sánh trình tự DNA của các dòng vi khuẩn trên NCBI Dòng.
- Vi Khuẩn Chiều.
- Bảng 3 cho kết quả 15 dòng vi khuẩn thuộc 6 chi, trong đó chi Acinetobacter (5 dòng), chi Bacillus (4 dòng), chi Burkholderia (2 dòng), chi Klebsiella (2 dòng), chi Enterobacter (1 dòng) và chi Sphingomonas (1 dòng).
- Tất cả đều là vi khuẩn nội sinh và có khả năng tổng hợp đạm, hòa tan lân khó tan, tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA..
- Cây phả hệ của 15 dòng vi khuẩn được xây dựng dựa theo phần mềm MEGA 6,06, với chỉ số bootstrap 1000.
- Cây phả hệ (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ di truyền của 15 dòng vi khuẩn nội sinh Hình 2 cho thấy các dòng vi khuẩn nội sinh của.
- Điều này có nghĩa có sự giao thoa về mặt di truyền giữa các dòng vi khuẩn nội sinh giữa 3 huyện và có thể lý giải là do vi khuẩn được phân tán theo nguồn giống (giống sử dụng tại huyện Vân Canh được sử dụng từ nguồn giống của huyện Vĩnh Thạnh hoặc An Lão hoặc ngược lại)..
- Nghiên cứu đã phân lập được 191 dòng vi khuẩn, trong đó dòng GN49a cố định đạm cao nhất với hàm lượng trung bình là 2,25 mg/L, dòng GN54b hòa tan được nhiều lân nhất với hàm lượng trung bình là 367,34 mg/L, dòng PR49a có khả năng tổng hợp IAA cao nhất với hàm lượng trung bình là 5,54 µg/L.
- Mười lăm dòng vi khuẩn có những đặc tính tốt được tuyển chọn để nhận diện bằng phương pháp PCR và giải trình tự DNA cho kết quả cả 15 dòng đều là vi khuẩn nội sinh và thuộc 6 chi, chi Acinetobacter (5 dòng), chi Bacillus (4 dòng), chi Burkholderia (2 dòng), chi Klebsiella (2 dòng), chi.
- Việc đánh giá ngoài đồng những dòng vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt đã được định danh, tiến tới nghiên cứu và sử dụng nguồn vi khuẩn nội sinh tốt làm phân sinh học để ứng dụng cho cây trồng là cần thiết..
- Vi khuẩn nội sinh thực vật (Endophytic bacteria).
- Phân lập và đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây Khóm trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An, Việt Nam.
- Tuyển tập công trình nghiên cứu của hội nghị Công nghệ sinh học năm 2009 tổ chức tại thành phố Hồ Chi Minh, 23-24, tháng 10 năm 2009, trang 69-73..
- Khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn Azospirillium lipoferum.
- Tuyển tập báo cáo Khoa học Hội nghị toàn Quốc 2007, Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống.
- Hiệu quả của vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân lên năng suất đậu phộng trồng trên đất cát tỉnh Trà Vinh.
- Phân lập và đặc tính của những dòng vi khuẩn nội sinh trong một số cây cỏ chăn nuôi