- PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN VÙNG RỄ. - Cố định đạm, hòa tan lân, IAA, rau ăn lá,. - siderophores, vi khuẩn vùng rễ. - Bảy mươi sáu dòng vi khuẩn được phân lập từ 25 mẫu đất vùng rễ của 13 loài rau ăn lá trồng tại 6 quận-huyện của Cần Thơ. - với 5 dòng (NBT625, NPD721, NPD855, NOM131 và NBT613) có khả năng cố định đạm, hòa tan lân cao mg/L NH 4. - Kết quả khảo sát khả năng sản xuất siderophores, có 7/8 dòng tạo được vòng sáng và làm đổi màu môi trường CAS. - Sáu dòng vi khuẩn này được chọn để nhận diện với cặp mồi 27F và 1492R và giải trình tự gen 16S rRNA, so sánh với gen 16S rRNA của vi khuẩn trong GenBank bằng chương trình BLAST N. - TCP30, và 5 dòng vi khuẩn được chọn đánh giá hiệu quả của chúng trên rau ăn lá trong chậu và ngoài đồng trừ dòng POM112.. - Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng ở thực vật (Plant Growth Promoting Rhizobacteria-PGPR) là vi khuẩn trong đất, sinh sống xung quanh hoặc trên bề mặt rễ, trực tiếp hoặc gián tiếp tham gia việc kích thích sinh trưởng và phát triển của thực vật thông qua sản xuất và tiết ra những chất hóa học khác nhau ở xung quanh vùng rễ. - Các vi khuẩn vùng rễ thực vật có lợi có thể làm giảm sự phụ thuộc hoàn toàn vào nông dược nguy hại gây bất ổn cho hệ sinh thái nông nghiệp. - Vì vậy, chúng rất quan trọng đối với khả năng phục hồi của đất.. - Vì thế, việc ứng dụng những vi khuẩn vùng rễ có lợi này trong sản xuất phân vi sinh bón cho cây trồng nói chung và rau xanh nói riêng, nhằm giảm sử dụng phân bón hóa học, góp phần bảo vệ sức khỏe con người và xây dựng hệ sinh thái nông nghiệp bền vững.. - Mục tiêu nghiên cứu là phân lập và nhận diện vi khuẩn vùng rễ kích thích sự sinh trưởng trên cây rau ăn lá trồng tại Cần Thơ.. - Các mẫu đất vùng rễ rau ăn lá (khoảng 2 kg đất bao gồm cả cây rau) được thu thập từ các ruộng rau tại 6 quận-huyện (Cái Răng, Bình Thủy, Phong Điền, Ô Môn, Cờ Đỏ, Thốt Nốt) của Cần Thơ. - Đất vùng rễ (lớp đất bao quanh rễ khoảng 0,8-10 mm) của từng mẫu rau được để riêng trong túi nilon sạch khuẩn (có ghi nhãn và số thứ tự), trữ trong tủ lạnh (4 o C) khi chưa sử dụng. - Gở lớp đất bao quanh rễ một cách nhẹ nhàng, tách riêng, trộn đều lại để sử dụng cho phân lập vi khuẩn (mô tả ở phần sau).. - 2.2 Phân lập vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng (PGGR). - Mẫu đất vùng rễ (1 g) được cho vào bình tam giác với 99 ml nước cất đã khử trùng, lắc 12 giờ (200 vòng/phút) cho các hạt đất rời ra và vi khuẩn phân tán đều trong nước. - Dịch vi khuẩn được để lắng khoảng 1 giờ. - lấy 0,1 ml trải đều trên đĩa petri chứa môi trường Burk không đạm (phát hiện vi khuẩn cố định đạm) (Park et al., 2005) và môi trường NBRIP (phát hiện vi khuẩn hòa tan lân) (Nautiyal, 1999) đã được chuẩn bị sẵn, ủ ở 30 o C.. - Sau 24-48 giờ, các khuẩn lạc mọc trên bề mặt môi trường được tiếp tục cấy chuyển sang môi trường mới vài lần đến khi các khuẩn lạc xuất hiện trên đường cấy rời nhau thì quan sát đặc điểm khuẩn lạc (hình dạng, màu sắc, độ nổi, dạng bìa, kích thước).. - Các dòng vi khuẩn phân lập được kiểm tra độ thuần bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. - Khi thấy vi khuẩn đã thuần nhất tiến hành cấy chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường đặc tương ứng để trữ ở 4 o C và được xem như một dòng thuần. - Các vi khuẩn phát triển được trên môi trường Burk không đạm được cấy sang môi trường NBRIP và ngược lại, chọn những khuẩn lạc phát triển trên cả hai môi trường Burk không đạm và NBRIP như là các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân.. - 2.3 Định lượng đạm, lân hòa tan, IAA ở những dòng vi khuẩn phân lập được. - Các dòng vi khuẩn phát triển trên từng loại môi trường được đo khả năng cố định đạm trong môi trường Burk không đạm lỏng bằng phương pháp so màu Indophenol Blue ở bước sóng 636 nm (OD 636nm. - đo khả năng hòa tan lân trong môi trường NBRIP lỏng bằng phương pháp so màu Blue-molypden ở bước sóng 880 nm (OD 880nm. - đo khả năng tổng hợp IAA trong môi trường phân lập lỏng bằng phương pháp so màu Salkowsky ở bước sóng 530 nm (OD 530 nm. - 2.4 Khảo sát khả năng sản xuất siderophores của các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn. - Vi khuẩn vùng rễ được tăng sinh trong môi trường PS (peptone 10g/L, sucrose 10g/L)(Schwyn và Neilands, 1987), lắc 200 vòng/phút, ở 30 o C trong 24 giờ. - Nhỏ giọt 50 μl dịch vi khuẩn lên môi trường chorome azurol S (CAS) agar và ủ ở 30 o C trong 48 giờ, sau đó quan sát khả năng sản xuất siderophores của từng dòng. - Khi vi khuẩn sử dụng sắt trong môi trường thì màu xanh của môi trường CAS xung quanh khuẩn lạc không còn nữa, thay vào đó vòng sáng màu cam xuất hiện quanh khuẩn lạc đó là do có sự hiện diện của siderophores (Schwyn và Neilands,1987).. - 2.5 Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR-16S rRNA. - Tách chiết DNA vi khuẩn theo mô tả của Wilson (1997).. - Sau khi tách chiết DNA từ các dòng vi khuẩn, phản ứng PCR gen 16S rRNA được tiến hành với cặp mồi 27F và 1492R (Weisburg et al., 1991) với trình tự như sau: 27F. - Sử dụng đoạn mồi 27F trong phản ứng PCR để nhận diện vi khuẩn đã mô tả ở trên. - Sử dụng chương trình BLAST N để so sánh trình tự DNA của các dòng vi khuẩn chọn lọc với trình tự DNA của bộ gen ở các loài vi khuẩn trong GenBank và xây dựng cây phả hệ gen giữa các dòng vi khuẩn được giải trình tự bằng phần mềm MEGA 6.05 (Tamura et al., 2011).. - Bảy mươi sáu dòng vi khuẩn được phân lập từ 25 mẫu đất vùng rễ của 13 loài rau ăn lá khác nhau thu được ở 6 quận-huyện của Cần Thơ, trong đó có 63 dòng phát triển trên cả hai loại môi trường Burk không đạm và môi trường NBRIP. - như vậy 63 dòng vi khuẩn này vừa có khả năng cố định đạm vừa có khả năng hòa tan lân (Hình 1), đa số chúng có khuẩn lạc tròn, trắng hoặc vàng, bìa nguyên, độ nổi mô (Hình 2). - tế bào hình que hay ovan, có khả năng chuyển động (Hình 3).. - Hình 1: Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập ở môi trường Burk không N phát triển trên môi trường NBRIP sau 48 giờ. - trắng trong, độ nổi mô) của một số dòng (isolate) vi khuẩn phân lập. - Hình 3: Hình dạng một số dòng vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét Chú thích: (A): Dòng PBT622 (X8.000). - Kết quả Bảng 1 và 2 cho thấy khả năng cố định đạm của 63 dòng vi khuẩn sau 8 ngày ủ, trong đó. - có 11 dòng vi khuẩn nổi bật thông qua hàm lượng NH 4 + tổng hợp khá cao mg/L).. - Bảng 1: Khả năng cố định đạm của 38 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Burk không đạm Stt Dòng. - vi khuẩn Lượng NH 4. - (mg/L) Stt Dòng vi. - Bảng 2: Khả năng cố định đạm của 25 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường NBRIP Stt Dòng vi. - Sau khi định lượng đạm, 26 dòng vi khuẩn phân lập ở môi trường Burk không đạm và 22 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường NBRIP được chọn để định lượng lân hòa tan và khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA). - Kết quả Bảng 3 và 4 cho thấy khả năng hòa tan lân của 48 dòng vi. - Trong đó, 11 dòng vi khuẩn có hàm lượng P 2 O 5 cao từ 41,43 mg/L đến 50,63 mg/L và 4 dòng vi khuẩn nổi bật thông qua hàm lượng IAA khá cao mg/L) là các dòng PBT622, PCD534, POM112 và POM222.. - Bảng 3: Khả năng hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA của 26 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Burk không đạm. - STT Dòng vi. - (mg/L) STT Dòng vi. - Bảng 4: Khả năng hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA của 22 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường NBRIP. - vi khuẩn Lượng P 2 O 5. - Sau khi định lượng đạm, lân hòa tan và IAA, 8 dòng vi khuẩn hữu hiệu nhất (có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA tốt và ổn định qua các ngày quan sát) được chọn để khảo sát khả năng sản xuất siderophores. - dòng vi khuẩn có khả năng làm thay đổi màu xanh của môi trường CAS thành màu cam xung quanh khuẩn lạc, qua đó cho thấy chúng có khả năng sử dụng sắt trong môi trường, góp phần ức chế vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (dòng NPD855 không có khả năng sản xuất siderophores)(Hình 4).. - Hình 4: Các dòng vi khuẩn làm xuất hiện vòng sáng màu cam sau 48 giờ phát triển trên môi trường CAS agar. - Hình 5: Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của 6 dòng vi khuẩn vùng rễ Ghi chú: 1=thang DNA chuẩn 100 bp plus, 2=NBT613, 3=NPD855, 4=PBT622, 5=POM112, 6=NBT625, 7=NPD721, 8=đối chứng âm. - Đồng thời, 8 dòng vi khuẩn này được nhận diện bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi 27F và 1492R. - Như vậy, trừ dòng POM112 đồng hình với dòng vi khuẩn có tác động xấu đến môi trường (nên loại ra), 5 dòng còn lại đều là vi khuẩn có ích sống ở vùng rễ hay nội sinh đã được công bố ở nhiều quốc gia khác nhau trong ngân hàng dữ liệu của NCBI.. - Cây phả hệ được xây dụng bằng phần mềm MEGA 6.05 Cây phả hệ (Hình 6) cho thấy 6 dòng vi khuẩn phân lập nằm trên 2 nhánh với nhánh 1 gồm các dòng NBT625, NOM131, NPD721, NPD855, PBT622, POM112, POM222, trong khi ở nhánh 2 chỉ có dòng NBT613.. - Vi khuẩn cùng rễ kích thích sự tăng trưởng đã được Kloepper và Schroth (1978) tìm ra và đặt tên cho nhóm vi khuẩn sống ở vùng rễ thực vật nhưng có nhiều ích lợi cho thực vật như cung cấp N sinh học, hòa tan lân khó tan, tổng hợp IAA, tạo siderophore giúp đối kháng lại nhóm vi sinh vật. - Vi khuẩn Alcaligenes, Azoarcus, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Klebsiella, Pantoe, Pseudomonas là những PGPR có khả năng cố định N sinh học (Hurel et al., 1994. - (2001) tìm thấy Bacillus pumulis và Bacillus licheniformis tạo nhiều IAA sống vùng rễ cây xà lách và Toro et al. - Gần đây (Farima et al., 2012) phân lập và nhận diện các. - dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens, Burkhoderia, Enterobacter, Pseudomonas là những PGGR có khả năng tổng hợp IAA, cố định N sinh học, hòa tan lân khó tan và tạo siderophores trong rễ cây canola. - Ngoài ra, vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans được tìm thấy trong đất, nước (McGuckin et al., 1982), là vi khuẩn gram âm hiếu khí, di động, hình que, được mô tả lần đầu vào năm 1971 bởi Yabuuchi và Ohyama, hai ông phát hiện chúng ở những bệnh nhân viêm tai giữa mãn tính vì vậy dòng này không được dùng để ứng dụng trên cây trồng mặc dù chúng cũng có những đặc tính mong muốn. - Những kết quả đạt được trong nghiên cứu này cũng phù hợp với những kết quả trước đây đã báo cáo kể cả dòng Achromobacter xylosoxidans, có lẽ dòng vi khuẩn là những mầm bệnh tiềm sinh trong đất nhưng cũng có những đặc tính như các PGGR để chúng có thể tồn tại trong điều kiện tự nhiên khi không có ký chủ.. - Bốn dòng vi khuẩn (NBT625, NBT613, NPD721, NPD855) có khả năng cố định đạm, hòa tan lân cao và dòng PBT622 có khả năng tổng hợp IAA cao đồng thời có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng, chúng được chọn để đánh giá hiệu quả của chúng trên rau ăn lá trồng trong chậu và ngoài đồng nhằm tiến tới sản xuất phân sinh học cho rau xanh.. - Bashan, Y., and de-Bashan, L.E., 2005.. - Thử nghiệm ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng, năng suất và phẩm chất. - Kloepper, J.W., and Schroth, M.N., 1978.. - Riggs, P.J., Chelius, M.K., Inguez, A.L., Kaeppier, S.M., and Triplett, E.W., 2001.. - Schwyn, B., and Neilands, J.B., 1987.. - Toro, M., Azcon, R., and Barea, J.M., 1997.. - Weisburg, W.G., Barns, S.M., Pelletier, D.A., and Lane, D.J., 1991. - Yabuuchi, E., and Ohyama, A., 1971.