Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân hủy chất hữu cơ và kháng khuẩn ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHẤT HỮU CƠ VÀ KHÁNG KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN.
- Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và sàng lọc một số chủng xạ.
- khuẩn từ bùn đáy ao nuôi tôm có khả năng phân hủy hữu cơ và kháng Vibrio parahaemolyticus trong điều kiện in vitro.
- Kết quả phân lập được 161 chủng có khả năng phát triển trên môi trường Starch Casein Agar (SCA), trong đó 54 chủng có đặc điểm nhận dạng giống với giống Streptomyces với các đặc điểm hình thái như tế bào gram dương, dương tính với catalase, âm tính với oxidase và có khả năng hình thành bào tử..
- Trong số 54 chủng, 12 chủng thể hiện hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus với đường kính vòng vô trùng dao động 2,3-32,8 mm, trong đó 04 chủng CM1.1, CM2.4, DH3.4 và TV1.4 thể hiện hoạt tính kháng cao nhất.
- Bên cạnh đó, chủng DH3.4 được coi là tiềm năng với khả năng sinh hoạt tính enzyme α-amylase, protease và cellulase tương đối cao.
- Do đó, các chủng này có thể được sử dụng cho các nghiên cứu in vitro and in vivo ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản..
- Mặt khác, việc sử dụng thuốc kháng sinh để trị bệnh trên động vật thủy sản thường xuyên và không đúng liều lượng đã tạo ra một số dòng vi khuẩn kháng thuốc..
- Vì vậy, cần phải có một giải pháp cải thiện chất lượng môi trường nuôi mà không ảnh hưởng đến động vật thủy sản và con người.
- Theo Bao and Shen (2005), hệ thống nuôi thủy sản bền vững cần có sự hiện diện của nhóm vi khuẩn có lợi (beneficial microorganisms), nhóm vi khuẩn này không chứa độc tố, không hiệu ứng phụ, không tồn lưu và không kháng kháng sinh, tuy nhiên nhóm vi khuẩn này hiệu quả trong việc cải thiện môi trường và tăng hệ miễn dịch của vật nuôi, giảm stress và duy trì trạng thái cân bằng của hệ sinh thái thủy vực.
- Xạ khuẩn được biết đến là một trong những đối tượng quan trọng nhất trong sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học (Sanglier, 1993.
- Mitra et al., 2008).
- Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong đất, chúng tham gia vào các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong đất nhờ các hoạt chất enzyme như protease, amylase, cellulase.
- Trong quá trình sống xạ khuẩn tiết ra nhiều chất có hoạt tính sinh học cao có khả năng kháng lại các loài vi sinh vật khác nhau bao gồm cả nấm và vi khuẩn.
- Trong số 23,000 hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ vi sinh vật, hơn 10,000 hợp chất được phân lập từ xạ khuẩn (Watve et al., 2001).
- Trong khoảng hơn 8.000 chất kháng sinh được biết trên thế giới hiện nay thì có hơn 80% trong số đó có nguồn gốc từ xạ khuẩn.
- Việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn mới có khả năng ứng dụng cao trong nuôi trồng thủy sản và tìm ra loại môi trường để chúng phát triển tối ưu phục vụ cho ao nuôi tôm, cá là rất cần thiết.
- Để nghiên cứu việc ứng dụng các chủng xạ khuẩn trong thủy sản, đề tài.
- “Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân hủy chất hữu cơ và kháng khuẩn ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản” được tiến hành..
- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.
- Phương pháp thu mẫu.
- 49 mm) theo mô tả của Somsiri et al.
- Mẫu bùn được thu 4-5 điểm xung quanh ao, sau đó trộn đều các mẫu lại với nhau để đồng nhất mẫu và bảo quản trong thùng lạnh, vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành xử lý và phân lập..
- Phân lập và nhận dạng xạ khuẩn Một gram mẫu bùn ao được pha loãng lần lượt với nước muối sinh lý tiệt trùng (0,85% NaCl) và trải trên môi trường đĩa thạch SCA (Starch Casein Agar) (bổ sung 1,5% NaCl) được bổ sung nystatin (25 μg/mL) và nalidixic acid (20 μg/mL) để hạn chế sự phát triển của nấm và vi khuẩn khác (Takizawa et al., 1993).
- Sau đó, các khuẩn lạc với hình dạng và kích thước khác nhau được chọn để tách ròng trên môi trường thạch SCA đến khi thu được khuẩn lạc thuần, tiến hành nhuộm Gram (Hucker &.
- Các chủng Gram.
- glycerol cho các nghiên cứu sau..
- Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn.
- Thí nghiệm khảo sát khả năng sinh hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp cấy vệt vuông góc theo mô tả trước đây của Chythanya et al.
- (2002) và Das et al.
- Cụ thể, các chủng xạ khuẩn phân lập được cấy vào trung tâm đĩa thạch NA (bổ sung 1% NaCl) một đường thẳng (rộng khoảng 0,5 cm), ủ đĩa ở 30C trong 7 ngày.
- Chủng vi khuẩn gây bệnh V.
- parahaemolyticus sử dụng trong nghiên cứu được phân lập từ tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) và lưu trữ tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật hữu ích- Bộ môn Thủy sinh học Ứng dụng - Khoa Thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ được phục hồi trên môi trường NA (bổ sung 1,5% NaCl)..
- Sau đó cấy chủng vi khuẩn Vibrio một đường vuông góc 90 với vệt cấy của xạ khuẩn.
- Quan sát khả năng đối kháng sau 24 giờ ở 30C bằng cách đo đường vô.
- trùng giữa chủng xạ khuẩn với các chủng vi khuẩn Vibrio.
- Đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào Các chủng xạ khuẩn kháng V.
- parahaemolyticus được chọn để tiến hành đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào trong điều kiện in vitro:.
- Hoạt tính protease: các chủng xạ khuẩn chọn lọc được nuôi trong môi trường khoáng cơ bản (bao gồm glucose 0,5 g/L.
- CaCl 2 1,0 g/L và K 2 HPO 4 0,5 g/L) bổ sung 1% casein (Abdullah Al-Dhabi et al., 2020).
- Sau 7 ngày nuôi ở 30℃ tiến hành thu dịch nổi (Cell-free supernatant, CFS) bằng phương pháp ly tâm lạnh ở vận tốc 8.500 vòng trong 10 phút ở 4℃ và xác định hoạt tính enzyme protease dựa theo mô tả Huynh et al.
- (2018) như sau: 100 L dịch CFS ủ với 100 L dung dịch 1% casein (pha trong dung dịch đệm Tris-HCl, pH 7,0) trong 10 phút ở 37C và 500 L dung dịch 5%.
- Sau 20 phút, hỗn hợp trên được ly tâm ở tốc độ 3.000 rpm trong 10 phút ở 4C và thu phần dịch nổi bên trên để xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Lowry (1951).
- Hoạt tính -amylase: dịch nổi CFS của các chủng xạ khuẩn sau 7 ngày nuôi trong môi trường sinh tổng hợp amylase (Kafilzadeh &.
- Hoạt tính -amylase được xác định theo mô tả của Bernfeld (1955) với một vài thay đổi.
- Cụ thể, phản ứng gồm 100 L dịch enzyme vi khuẩn ủ với 100 L dung dịch 1% soluble starch (pha trong dung dịch đệm NaH 2 PO 4 20 mM và NaCl 6,7 mM) trong ống nghiệm thủy tinh ở 37 C trong 15 phút..
- Hoạt tính cellulase: xạ khuẩn nuôi trong môi trường khoáng cơ bản (Fatokun et al., 2016) gồm 1,0.
- Sau 7 ngày nuôi, thu dịch CFS bằng phương pháp ly tâm để xác định hoạt tính enzyme theo mô tả Ghose (1987) có điều chỉnh.
- pH 5,0) và 0,5 mL dịch enzyme vi khuẩn được ủ ở 50C trong 30 phút, sau đó Thêm 1,5 mL dung dịch thuốc thử DNS (Miller, 1959) vào phản ứng và đun nóng 100C trong 10 phút.
- Phương pháp xử lý số liệu.
- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.
- Phân lập, sàng lọc và nhận dạng các giống xạ khuẩn.
- Tổng cộng 162 chủng xạ khuẩn được phân lập từ mẫu bùn ao nuôi tôm (12 mẫu ở Trà Vinh, 11 mẫu ở Bạc Liêu và 17 mẫu ở Cà Mau), trong đó 51 chủng có nguồn gốc từ ao tôm thuộc tỉnh Trà Vinh, 54 chủng từ mẫu bùn ao tôm ở Bạc Liêu và 57 chủng từ bùn ao tôm thuộc tỉnh Cà Mau.
- Hầu hết các chủng phân lập phát triển trên môi trường SCA ở 30C sau 7 ngày nuôi với các đặc điểm hình thái như kích thước khuẩn lạc dao động 1,1-2,8 mm, rìa không đều, màu sắc đa dạng từ màu trắng phấn (55.
- Bên cạnh đó, kết quả kiểm tra sinh hóa cho thấy 54 chủng đều bắt màu với thuốc nhuộm crystal violet chứng tỏ các chủng này là vi khuẩn gram dương.
- Các đánh giá kiểm tra sinh hóa khác cho kết quả dương tính với catalase, âm tính với oxidase và có khả năng hình thành bào tử (Hình 1 và Bảng 2).
- Các chủng phân lập có khả năng phát triển ở ngưỡng pH từ 4- 11 và ở nồng độ muối lên đến 5% NaCl..
- Nhiều nghiên cứu trước đây đã phân lập các loài thuộc giống Streptomyces từ nhiều nguồn khác nhau (bùn đáy, đất canh tác, ruột cá.
- và phát triển thành các probiotic sử dụng hiệu quả trong nuôi tôm biển (Das et al., 2010.
- Vignesh et al., 2019.
- Suástegui et al., 2020).
- Trong nghiên cứu của.
- García-Bernal et al.
- (2015) cho thấy 31 chủng được phân lập từ bùn đáy biển với màu sắc khuẩn lạc đa dạng từ trắng, hồng, vàng và tím.
- Các chủng phân lập có khả năng phát triển ở nồng độ pH lớn hơn 3 và nồng độ muối NaCl 10% trên môi trường nuôi cấy..
- Kết quả kiểm tra sinh hóa bằng bộ kit API 20 E.
- Đặc điểm Chủng TV1.4 Chủng DH3.4 S.
- caldifontis (Amin et al., 2016).
- drosdowiczii (Amin et al., 2016).
- Khuẩn lạc xạ khuẩn trên môi trường SCA (B, D) và kết quả nhuộm Gram (A, C) 3.2.
- Sàng lọc các chủng có hoạt tính kháng.
- Kết quả sàng lọc 54 chủng bằng phương pháp cấy vệt vuông góc cho thấy có 13 chủng có khả năng kháng V.
- 1 chủng kháng trung bình (CM1.1) và 3 kháng mạnh (CM2.4, DH3.4 và TV1.4) (Lorian, 1995).
- (2016) đã nghiên cứu về khả năng kháng V.
- paraheamolyticus của 96 chủng xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.
- Kết quả tác giả đã sàng lọc được 3 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, trong số đó chủng 25.2 (Streptomyces aureofaciens) có khả năng đối kháng mạnh với đường kính dòng vô khuẩn là 15 mm thấp hơn kết quả nghiên cứu của chúng tôi (chủng xạ khuẩn TV1.4 có vòng kháng khuẩn 32,8 mm).
- Thê vào đó trong những năm gần đây, đã có một số công bố trên thế giới về việc tìm ra các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với V.
- với những kết quả này và trước đây, chủng xạ khuẩn TV1.4 trong nghiên cứu này có hoạt tính kháng khuẩn tương đối mạnh (Selvakumar et al., 2010)..
- STT Chủng phân lập Đường kính vòng kháng (mm).
- Khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp cấy vệt vuông góc 3.3.
- Hoạt tính enzyme ngoại bào.
- Sau khi kiểm tra khả năng kháng V..
- parahaemolyticus, 4 chủng có kết quả hoạt tính cao nhất (CM1.1, CM2.4, DH3.4, TV1.4) được chọn để kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào (Hình 3).
- Kết quả đánh giá cho thấy hoạt tính protease của chủng TV U/mL) và DH U/mL) cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với các chủng còn lại (p<0,05).
- Bên cạnh đó, hoạt tính.
- amylase của chủng DH3.4 đạt giá trị cao nhất U/mL) trong khi đó không có sự khác biệt ý nghĩa (p>0,05) giữa hai chủng TV1.4 và CM1.1.
- Kết quả ghi nhận hoạt tính cellulose cho thấy chủng CM2.4 và DH3.4 đạt giá trị lần lượt là 119±7,6 U/mL, 84±7,7 U/mL, cao hơn có ý nghĩa (p<0,05) so với các chủng còn lại và không có sự khác biệt giữa hai chủng TV1.4 và CM1.1 (p>0,05)..
- Hoạt tính enzyme ngoại bào protease (A), amylase (B) và cellulase (C) của các chủng vi khuẩn chọn lọc.
- TV1.4 DH3.4.
- Trong báo cáo của Al-Dhabi et al.
- (2020), hoạt tính enzyme protease của chủng Streptomyces sp..
- trong khi đó nghiên cứu của Dastager et al.
- (2008) cho thấy hoạt tính enzyme của vi khuẩn Streptomyces gulbargensis sp.
- Ngoài ra, hoạt tính -amylase của chủng Streptomyces fragilis DA7-7 theo báo cáo trước đây là 911,48 U/mL (Nithya et al., 2017) sau 3 ngày nuôi ở 28℃ trong môi trường ISP2.
- Hơn nữa, chủng Streptomyces longispororuber C188 được kiểm tra hoạt tính cellulase đạt giá trị 15490 U/L (tương ứng 15,49 U/mL) sau 4 ngày nuôi ở 30°C trong môi trường CMC bổ sung 1% Corn Steep Liquor (Mahmoud et al., 2014).
- Trong nghiên cứu hiện tại, cả 4 chủng khảo sát đều cho kết quả hoạt tính enzyme cao hơn so với các kết quả nghiên cứu trước đây.
- Dựa vào kết quả ghi nhận, cả 3 chủng TV1.4, CM2.4 và DH3.4 với hoạt tính enzyme và khả năng kháng khuẩn mạnh nhất cho thấy đây là những chủng tiềm năng để chọn lọc và tiến hành các thí nghiệm tiếp theo..
- Ba chủng xạ khuẩn TV1.4, CM2.4 và DH3.4 có khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus mạnh nhất dựa vào đường kính của vòng kháng khuẩn.
- Đồng thời, cả ba chủng đều có hoạt tính enzyme mạnh, đặc biệt là chủng xạ khuẩn DH3.4 có cả ba hoạt tính enzyme protease, amylase và cellulase..
- Nghiên cứu chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus gây bệnh trên tôm