- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN Acetobacter SP.. - Acetobacter xylinum, màng cellulose, nước mía, vi khuẩn tạo màng cellulose. - Ngày nay, màng cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau, đặc biệt trong lĩnh vực y học như: làm da tạm thời, điều trị bỏng, làm mặt nạ dưỡng da cho người. - Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích phân lập và tuyển chọn được dòng vi khuẩn Acetobacter sp. - có khả năng lên men tạo màng cellulose từ nước mía. - Kết quả đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn Acetobacter spp., trong đó, dòng BK3 cho khối lượng cao nhất về màng celllulose tươi (134,48 g/200mL) và màng celllulose khô (1,4 g/200mL) sau bảy ngày lên men. - Sử dụng dòng vi khuẩn BK3 lên men với môi trường lên men phối chế ban đầu với nước mía có độ Brix là 8, pH 5,2 và mật số chủng giống vi khuẩn là 10 7 tế bào/mL lên men 7 ngày cho kết quả khối lượng màng cellulose tươi là 140,26 g/200mL và màng celllulose khô là 1,635 g/200mL. - Bằng phương pháp giải trình tự, kết quả định danh dòng BK3 đồng hình 99% với vi khuẩn Acetobacter xylinum. - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter sp. - lên men tạo màng cellulose từ nước mía. - Tùy vào từng đặc điểm, chức năng và mục đích sử dụng của mỗi loài vi sinh vật mà chúng được con người ứng dụng vào các lĩnh vực khác nhau trong đời sống như: y tế, thực phẩm, mỹ phẩm, bảo vệ môi trường… Một trong những sản phẩm được tạo ra từ vi khuẩn vẫn đang được nghiên cứu và phát triển đó là màng sinh học cellulose vi khuẩn (bacterial cellullose - BC).. - Hơn nữa, cellulose vi khuẩn có bản chất hóa học tương tự cellulose thực vật và nhờ sản xuất dễ dàng, có đặc tính cơ học, độ tinh khiết cao, cấu trúc siêu mịn, xốp, chống nước tốt, tính ổn định dưới hóa chất và nhiệt độ cao nên cellulose vi khuẩn là vật liệu được chọn cho nhiều ứng dụng (Watanabe et al., 1998). - Một số nghiên cứu về cellulose từ vi khuẩn đã được ứng dụng ở các lĩnh vực khác nhau trong đời sống hằng ngày, ví dụ như ở lĩnh vực y tế thì BC làm da nhân tạo để hỗ trợ điều trị bỏng, tạo mạch máu nhân tạo trong điều trị bệnh tim mạch (Klemn et al., 2001), lĩnh vực thực phẩm BC được ứng dụng trong sản xuất thạch dừa (Alaban, 1967), màng bao thực phẩm, màng cố định trong sản xuất rượu vang (Yoshinaga et al., 1997), lĩnh vực mỹ phẩm như mặt nạ dưỡng da, chất làm nền cho móng nhân tạo (Sattler and Fiedler, 1990), lĩnh vực môi trường như miếng xốp làm sạch các vết dầu tràn và chất độc hại, màng siêu lọc làm sạch nguồn nước (El-Saied et al., 2004).. - Hiện nay, nước dừa khô là nguồn nguyên liệu chính dùng để sản xuất cellulose vi khuẩn ở Việt Nam và hầu hết các nước trên thế giới. - Mục tiêu của nghiên cứu nhằm tìm nguồn nguyên liệu mới thay thế góp phần giải quyết vấn đề khan hiếm nguồn nguyên liệu nước dừa, mặt khác có thể làm tăng khả năng tổng hợp màng cellulose vi khuẩn từ một nguồn nguyên liệu mới là nước mía.. - Dòng vi khuẩn Acetobacter sp. - Môi trường phân lập vi khuẩn YPGD (yeast extract-pepton-glycerol-Dglucose) agar: yeast extract (5 g/L), pepton (5 g/L), glycerol (5 g/L), D- glucose (5 g/L), agar (2 g/L). - 2.2.1 Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn Acetobacter spp. - Do mẫu là dịch giống nên có mật độ vi khuẩn Acetobacter sp. - Quá trình cấy trải để phân lập vi khuẩn acetic sử dụng các dụng cụ đã được khử trùng và tiến hành trong tủ cấy vô trùng.. - Dòng vi khuẩn acetic được đánh giá ròng khi hình dạng các tế bào quan sát được dưới kính hiển vi đồng nhất nhau. - Khi các dòng vi khuẩn acetic đã ròng tiến hành trữ giống trên các ống thạch nghiêng ở 4 o C để giữ nguyên các đặc tính ban đầu của giống.. - Những dòng vi khuẩn có đặc điểm như sau được xem xét là thuộc vi khuẩn acid acetic: Gram âm, catalase dương tính, tạo màng cellulose, tạo vòng halo sáng xung quanh khuẩn lạc trên môi trường YPGD có bổ sung 0,5% CaCO 3 . - Những dòng vi khuẩn được xác định là vi khuẩn acid acetic sẽ được chọn và cấy thử khả năng oxy hóa lactate thành CO 2. - và H 2 O trên môi trường YPGD bổ sung bromocresol green 0,01% để phân biệt những dòng vi khuẩn này thuộc giống Acetobacter hay Gluconobacter. - 2.2.2 Tuyển chọn dòng vi khuẩn có hoạt lực tạo màng cellulose cao nhất từ các dòng vi khuẩn Acetobacter spp. - Các dòng vi khuẩn Acetobacter spp. - phân lập được và dòng vi khuẩn Acetobacter sp. - đối chứng của phòng thí nghiệm được nuôi tăng sinh trên môi trường YPGD không có agar trong 48 giờ sau đó tiếp tục tăng sinh trên môi trường nước mía (nước mía 10%, glucose 3,65%, pepton 0,93%, SA 0,8%, DAP 0,2%, nước cất vừa đủ 100 mL) sau 5 ngày ở nhiệt độ phòng và tiến hành đếm mật số vi khuẩn bằng buồng đếm hồng cầu.. - Cho vào khay nhựa (17,3 x 13 x 7,3) cm 200 mL môi trường nước mía đã điều chỉnh về pH 5,2 và độ Brix 8, khử trùng bằng nồi khử trùng nhiệt ướt ở 115 0 C trong 10 phút để nguội, chủng các dòng vi khuẩn (A1, A2…A22) đã tăng sinh vào khay cùng mật số 10 6 tế bào/mL, ủ trong 144 giờ ở nhiệt độ phòng. - 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình lên men tạo màng cellulose từ dòng vi khuẩn Acetobacter sp. - Dòng vi khuẩn đã được tuyển chọn từ thí nghiệm trên nuôi tăng sinh trên môi trường YPGD không có agar trong 48 giờ sau đó tiếp tục tăng sinh trên môi trường nước mía (nước mía 10%, đường glucose 3,65%, pepton 0,93%, SA 0,8%, DAP 0,2%, nước cất vừa đủ 100 mL) 5 ngày ở nhiệt độ phòng và xác định mật số vi khuẩn bằng buồng đếm hồng cầu.. - 115 0 C trong 10 phút để nguội, chủng dòng vi khuẩn A đã tăng sinh vào các khay với cùng mật số 10 6 tế bào/mL, ủ ở nhiệt độ phòng với thời gian kết thúc quá trình lên men lần lượt là (B1, B2. - 2.2.4 Ảnh hưởng của các nhân tố (độ Brix, pH và mật số vi khuẩn ban đầu) đến quá trình lên men tạo màng cellulose từ môi trường nước mía. - Chủng vi khuẩn được tuyển chọn vào các khay nhựa với các mức mật số tế bào/mL.. - Chủng vi khuẩn A được nuôi tăng sinh trên môi trường YPGD trong 48 giờ sau đó tiếp tục tăng sinh trên môi trường nước mía (nước mía 10%, đường glucose 3,65%, pepton 0,93%, SA 0,8%, DAP 0,2%, nước cất vừa đủ 100 mL) 5 ngày và đếm mật số bằng buồng đếm hồng cầu.. - Khi quá trình lên men kết thúc tiến hành thu nhận khối lượng tươi và khô, đo độ dày màng cellulose, đo độ Brix, pH sau lên men rồi phân tích các chỉ tiêu, chọn nghiệm thức phù hợp nhất về độ Brix, pH và mật số vi khuẩn Acetobacter sp. - để lên men tạo màng cellulose từ nước mía.. - Chủng dòng vi khuẩn BK3 được tăng sinh trên môi trường YPGD trong 48 giờ sau đó tiếp tục tăng sinh trên môi trường nước mía (nước mía 10%, đường glucose 3,65%, pepton 0,93%, SA 0,8%, DAP 0,2%, nước cất vừa đủ 100 mL) 5 ngày vào mỗi khay với mật số vi khuẩn là 10 6 tế bào/mL ở nhiệt độ phòng sau 7 ngày và tiến hành thu sản phẩm màng cellulose.. - 2.2.6 Định danh dòng vi khuẩn Acetobacter sp. - Sau khi lên men tạo màng cellulose chọn được dòng vi khuẩn Acetobacter sp. - tốt nhất với các thông số tối ưu để giải trình tự gen 16S rRNA, sau đó so sánh đối chiếu trên ngân hàng gene (NCBI) từ đó xác định đến cấp loài dòng vi khuẩn đã phân lập.. - 3.1 Kết quả phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn Acetobacter spp. - từ dịch lên men tạo màng cellulose. - Tổng cộng có 21 dòng vi khuẩn đã được tách ròng trên môi trường YPGD từ 6 mẫu dịch giống tại 6 cơ sở sản xuất thạch dừa ở tỉnh Bến tre, 2 mẫu. - Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn. - Khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập được đều hình tròn, nhô và màu trắng sữa. - Tế bào các dòng vi khuẩn phân lập được khi quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính E100 đều có dạng hình que ngắn, kết đôi, di chuyển chậm.. - STT Dòng vi khuẩn Catalase Nhuộm Gram Tạo vòng halo Bromocresol green. - Hình 2: Môi trường bổ sung bromocresol green (trái), vi khuẩn làm đổi màu môi trường từ. - Kết quả kiểm tra sinh lý, sinh hóa như: catalase, nhuộm Gram, tạo vòng halo trên môi trường bổ sung CaCO 3 , chuyển môi trường bổ sung bromocresol green từ xanh lam sang vàng của 21 dòng vi khuẩn được trình bày ở Bảng 1.. - Qua các thử nghiệm trên có thể kết luận các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc nhóm Acetobacter dựa trên các cơ sở sau: Gram âm, có enzyme. - catalase, tế bào vi khuẩn có dạng hình que, tạo vòng sáng halo trên môi trường YPGD có bổ sung CaCO 3 , chuyển màu môi trường YPGD có bổ sung bromocresol green từ xanh lam sang vàng và ngược lại.. - 3.2 Tuyển chọn dòng vi khuẩn có hoạt lực tạo màng cellulose cao nhất trên cơ chất nước mía từ các dòng đã phân lập. - Các dòng vi khuẩn phân lập sau khi nuôi tăng sinh và xác định mật số được tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng lên men trong khay nhựa trên cơ chất nước mía 10 °Brix, pH 5,2 ở nhiệt độ phòng.. - Kết quả đánh giá đặc điểm và khối lượng của màng cellulose do các dòng vi khuẩn tổng hợp được thể hiện sau 6 ngày lên men. - Kết quả ở Bảng 2 cho thấy khối lượng cellulose của 22 dòng vi khuẩn Acetobacter spp. - có sự khác biệt khi lên men từ cơ chất nước mía. - Chủng vi khuẩn BK3 có khả năng lên men tạo sản lượng cellulose cao nhất (134,48 g/200mL) và có khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với chủng đối chứng TB của phòng thí nghiệm cũng như các chủng được phân lập còn lại ở độ tin cậy 95%.. - Bảng 2: Khối lượng màng cellulose thu được của 22 dòng vi khuẩn sau 6 ngày lên men. - 3.3 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men tạo màng cellulose của dòng vi khuẩn BK3 từ cơ chất nước mía. - Mật số vi khuẩn môi trường tăng sinh là 5,8 x 10 8 tế bào/mL. - Bảng 3: Khối lượng cellulose lên men từ cơ chất nước mía ở các mức thời gian. - Kết quả khối lượng khô đạt được 1,58 g/200mL sau 7 ngày lên men ở Bảng 3 cao hơn với nghiên cứu của Nguyễn Thúy Hương và Phạm Thành Hổ (2003) đạt 1,43 g/200mL khi lên men dòng vi khuẩn Acetobacter xylinum P.16 sau 6 ngày trên môi trường nước mía và thấp hơn nghiên cứu của Chawla et al. - (2008) đã lên men dòng Acetobacter xylinum sp. - 3.4 Ảnh hưởng của độ Brix, pH và mật số vi khuẩn của dòng BK3 đến quá trình lên men tạo màng cellulose từ cơ chất nước mía. - độ Brix, pH và mật số vi khuẩn ban đầu thích hợp cho quá trình lên men tạo ra sản lượng cellulose từ môi trường nước mía, thời gian lên men 7 ngày được trình bày ở Bảng 4. - Bảng 4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ Brix, pH và mật số vi khuẩn ban đầu đến khối lượng cellulose của chủng vi khuẩn BK3 trên cơ chất nước mía. - vi khuẩn(tb/mL) Brix sau. - lên men pH sau. - lên men Độ dày (cm). - Độ Brix trước lên men dao động từ 6 đến 10, pH sau lên dao động từ 3,31 đến 3,82 chứng tỏ trong quá trình lên men vi khuẩn sử dụng đường tạo ra acid gluconic làm cho pH giảm và độ Brix sau khi lên men đều giảm 1,85 đơn vị so với độ Brix ban đầu chứng tỏ vi khuẩn sử dụng glucose chuyển hóa trực tiếp thành cellulose và lượng đường bổ sung là nguồn cung cấp carbon và năng lượng cho quá trình lên men của vi khuẩn.. - Từ kết quả thống kê khối lượng và độ dày của màng cellulose chứng tỏ nghiệm thức 15 với độ Brix là 8 o , pH 5,2 và mật số vi khuẩn là 10 7 tế bào/mL đạt khối lượng và độ dày cao nhất.. - Nguyễn Thúy Hương (2006) và Phạm Văn Phiến (2014) khi lên men tạo màng cellulose tươi đạt khối lượng cao nhất là 109,8 g/200mL sau 4 ngày từ vi khuẩn Acetobacter xylinum trên môi trường nước mía với pH 5,2. - Kết quả thí nghiệm cho thấy tổ hợp nghiệm thức độ Brix 8 – pH 5,2 – mật số 10 7 thì dòng vi khuẩn BK3 lên men tốt nhất tạo ra khối lượng màng cellulose cao nhất là 140,26 g/200mL trên môi trường nước mía trong thời gian 7 ngày, và kết quả trên là kết quả thực nghiệm. - Như vậy khối lượng cellulose tối ưu tính toán với độ Brix là 8,5, pH tối ưu là 5,1 và mật số vi khuẩn. - Các thông số tối ưu này có giá trị pH và mật số vi khuẩn tương đương với các thông số của nghiệm thức tốt nhất thí nghiệm, chứng tỏ thí nghiệm được bố trí tối ưu.. - Hình 3: Biểu đồ đường mức thể hiện sự tương quan giữa mật số vi khuẩn và pH ban đầu đến. - Hình 4: Biểu đồ mặt đáp ứng thể hiện sự tương quan giữa mật số vi khuẩn và pH ban đầu đến. - Như vậy, điều kiện tối ưu lên men tạo cellulose của chủng vi khuẩn BK3 trên cơ chất nước mía là độ Brix 8,5, pH 5,1 và mật số vi khuẩn 10 6 tế bào/mL.. - mật số vi khuẩn dòng BK3 là 10 6 tế bào/mL. - Kết quả lên men tạo màng cellulose từ môi trường nước mía thời gian 7 ngày được trình bày trong Bảng 5. - mật số vi khuẩn là 10 6 tế bào/mL trên các khay 200 mL và khay lớn 1000 mL kết quả khối lượng màng cellulose thu được ở các khay 200 mL (trung bình đạt 144,33 g/200mL tươi và 1,76 g/200mL khô) và 1000 mL (trung bình đạt 715 g/1000mL tươi và 9,14 g/1000mL khô), cao hơn so với các thông số khi bố. - mật số vi khuẩn là 10 7 tế bào/mL chỉ đạt 140,26 g/200mL tươi và 1,635 g/200mL khô (tương đương với kết quả khối. - Bảng 5: Kết quả lên men tạo màng cellulose từ những thông số tối ưu trên các khay lớn từ môi trường nước mía. - lên men pH sau lên. - Khi lên men từ các thông số tối ưu kết quả khối lượng cellulose khô đạt được trung bình của 3 lần lặp lại là 9,14 g/1000mL cũng tương đương với nghiên cứu của Yoshinaga et al., (1997) đạt 9,15 g/1000 mL khi lên men dòng vi khuẩn Acetobacter xylinum sp. - (BPR2002) trên môi trường có đường sucrose và cao hơn so với nghiên cứu của Chawla et al., (2008) đạt 8,7 g/1000mL khi lên men vi khuẩn Acetobacter xylinum sp. - sucrofermentans BPR2001 trên môi trường có fructose và Nguyễn Thúy Hương (2006) là 7,53 g/1000mL khi lên men vi khuẩn Acetobacter xylinum trên môi trường nước mía.. - Như vậy, dòng BK3 là dòng vi khuẩn có hoạt lực lên men tạo màng cellulose cao nhất trên cơ chất nước mía.. - 3.6 Định danh dòng vi khuẩn BK3 tuyển chọn được bằng phương pháp giải trình tự. - Kết quả giải trình tự dòng vi khuẩn BK3 gồm 912 base với cặp primer 1492R (5’- TACGGTTACCTTGTTACGACT- 3’) và 27F (5’- AGAGTTTGATCCTGGCTC - 3’). - Trình tự đoạn gen được giải gồm 912 base nitrogen và đoạn gen này được so sánh vi khuẩn trên Genbank (NCBI) với phần mềm nucleotide BLAST (Hình 5). - Sau khi giải trình tự và BLAST trên NCBI cho thấy có nhiều dòng vi khuẩn cho kết quả phù hợp với dòng BK3 và E value là 0,0. - Hình 5: So sánh trình tự vi khuẩn BK3 trên Genbank sử dụng nucleotide BLAST Như vậy, kết quả định danh dòng vi khuẩn BK3. - tương đồng với vi khuẩn Acetobacter xylinum.. - Kết quả đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn Acetobacter spp. - Sử dụng dòng vi khuẩn BK3 lên men với môi trường lên men phối chế ban đầu là Brix 8, pH 5,2 và mật số vi khuẩn là 10 7 tế bào/mL lên men 7 ngày cho kết quả khối lượng màng cellulose tươi là 140,26 g/200mL và màng khô là 1,635 g/200mL. - Bằng phương pháp giải trình tự, kết quả định danh dòng BK3 đồng hình 99% với vi khuẩn Acetobacter xylinum.. - Tuyển chọn và cải thiện các chủng Acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng ở quy mô pilot.