- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT PHÂN HỦY PHENOL TỪ MẪU BÙN KHU CHỨA NƯỚC THẢI PHÒNG THÍ NGHIỆM THUỘC KHOA NÔNG NGHIỆP, TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ. - 28S-rRNA, Candida tropicalis, phân hủy sinh học, phenol. - Nghiên cứu nhằm phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy phenol từ mẫu bùn khu chứa nước thải phòng thí nghiệm thuộc Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ. - Kết quả nghiên cứu cho thấy cả ba hệ vi sinh vật từ mẫu bùn và mẫu đất đều có khả năng phân hủy phenol cao và dao động trong khoảng từ 87,6% đến 91,5% sau 5 ngày nuôi cấy. - Hai dòng nấm men ký hiệu PS1.1 và PS6 trong số 28 dòng vi khuẩn và nấm men phân lập được có khả năng phân hủy phenol rất cao trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung 500 mg.L -1 phenol với phần trăm phân hủy lần lượt đạt 98,9% và 97,6% sau 5 ngày nuôi cấy. - Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân hủy phenol từ mẫu bùn khu chứa nước thải phòng thí nghiệm thuộc Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ. - Hiện nay, biện pháp sinh học thông qua việc sử dụng vi sinh vật (VSV) có khả năng phân hủy phenol cao nhằm xử lý ô nhiễm phenol lưu tồn trong nước, đất và trầm tích là một trong những biện pháp xử lý phenol được ưu tiên lựa chọn vì có hiệu quả cao, tiết kiệm và thân thiện với môi trường sinh thái. - Nhiều nghiên cứu trước đây trên thế giới cho thấy một số loài vi khuẩn và nấm men như Pseudomonas putida, Acinetobacter sp., (Kafilzadeh and Mokhtari, 2013) Candida tropicalis (Jiang et al., 2018), Cryptococcus terreus, Rhodotorula creatinivora (Krallish et al., 2006) phân lập có khả năng phân hủy phenol cao và được ứng dụng rộng rãi trong xử lý ô nhiễm phenol. - Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về phân lập các vi sinh vật mà đặc biệt là nấm men có khả năng phân hủy phenol và ứng dụng chúng trong xử lý môi trường đất, nước và trầm tích ô nhiễm với phenol còn rất hạn chế. - Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu phân lập, tuyển chọn và định danh dòng VSV có khả năng phân hủy phenol cao từ mẫu bùn ao chứa nước thải từ phòng thí ngiệm và mẫu đất trồng cỏ.. - Hai mẫu bùn được dùng trong phân lập VSV có khả năng phân hủy phenol được thu thập tại ao khu chứa nước xả thải Phòng thí nghiệm Hóa học đất và Phòng thí nghiệm Sinh học đất trong thời gian dài và một mẫu đất trồng cỏ thuộc khuôn viên Khoa. - 2.2 Làm giàu mật số VSV có khả năng phân hủy phenol trong hệ VSV và đánh giá khả năng phân hủy phenol của hệ VSV. - 2.2.1 Làm giàu mật số vi sinh vật có khả năng phân hủy phenol trong hệ vi sinh vật. - Nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự nhưng không cho mẫu bùn hoặc đất vào bình chứa môi trường nuôi cấy. - 2.2.2 Đánh giá khả năng phân hủy phenol của 3 hệ VSV sau khi được làm giàu mật số trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung phenol. - Sau 5 thế hệ nuôi cấy liên tục nhằm gia tăng mật số VSV có khả năng phân hủy phenol ở mục 2.2.1, 1 mL dịch VSV ở thế hệ thứ 5 được chuyển vào bình tam giác chứa 49 mL môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung 500 mg.L -1 phenol. - Nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự nhưng không được chủng VSV.. - 2.3 Phân lập VSV có khả năng phân hủy phenol. - Sau khi đánh giá khả năng phân hủy phenol của các hệ VSV trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng tiến hành chọn các hệ VSV có khả năng phân hủy phenol với hiệu suất cao để tiến hành phân lập và tách ròng các dòng VSV có khả năng phân hủy phenol. - 2.4 Đánh giá và so sánh khả năng phân hủy phenol của một số dòng vi sinh vật tuyển chọn. - Các dòng VSV sau khi phân lập tiến hành bố trí thí nghiệm để đánh giá và so sánh khả năng phân hủy phenol trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung phenol. - Đồng thời, hệ VSV có khả năng phân hủy phenol cao cũng được đưa vào thí nghiệm chung với các dòng VSV tuyển chọn nhằm so sánh hiệu quả phân hủy phenol giữa dòng đơn và cộng đồng. - Nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự nhưng không được chủng VSV. - 2.5 Định danh dòng VSV có khả năng phân hủy phenol cao. - Chọn ra dòng VSV thể hiện khả năng phân hủy phenol cao nhất sau 5 ngày nuôi cấy ở mục 2.4 để tiến hành ly trích DNA. - 3.1 Khả năng phân hủy phenol của ba hệ VSV từ mẫu bùn và đất. - Kết quả khảo sát khả năng phân hủy phenol trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung 500. - mg.L -1 phenol của ba hệ VSV sau 5 ngày nuôi cấy (Hình 1) cho thấy cả 3 hệ VSV thử nghiệm đều thể hiện khả năng phân hủy phenol tốt trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung phennol.. - Hình 1: Diễn biến nồng độ phenol còn lại trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng của các nghiệm thức thí nghiệm (n=3, độ lệch chuẩn). - Trong suốt thời gian thí nghiệm, nghiệm thức đối chứng không chủng VSV có nồng độ phenol trong môi trường nuôi cấy ổn định và giảm rất ít không đáng kể so với nồng độ chủng ban đầu (500 mg.L -1 ) và luôn cao hơn rất nhiều và khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so so với các nghiệm thức chủng VSV.. - Sự khác biệt giữa ba hệ VSV về khả năng phân hủy phenol được thể hiện rõ nhất ở sau 1 ngày thí nghiệm. - Ở ngày này, nghiệm thức được chủng với hệ VSV có nguồn gốc từ mẫu bùn Phòng thí nghiệm Hóa học đất có nồng độ phenol còn lại thấp nhất (283 mg.L -1 so với nồng độ bố trí ban đầu là 500 mg.L -1. - chiếm 36,3% hiệu suất phân hủy phenol và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng và 2 nghiệm thức còn lại (p<0,05). - Trong khi đó, nghiệm thức được chủng với hệ VSV có nguồn gốc từ mẫu bùn Phòng thí nghiệm Sinh học đất và từ mẫu đất trồng cỏ có nồng độ phenol còn lại trong môi trường nuôi cấy đạt lần lượt 346 và 352 mg.L -1 và tương đương 17,3 và 15,9% hiệu suất phân hủy phenol. - Mặc dù, hai nghiệm thức này có nồng độ phenol còn lại trong môi trường nuôi cấy khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi so sánh với. - nhau nhưng thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng (p< mg.L -1. - Đặc biệt ở ngày 3 và 5 sau khi bố trí thí nghiệm, nồng độ phenol của 3 nghiệm thức chủng VSV hầu như được phân hủy hoàn toàn. - Điều này cho thấy cả 3 hệ VSV từ bùn và đất sau 5 thế hệ nhân mật số các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy phenol thể hiện khả năng phân hủy rất hiệu quả phenol với tỉ lệ phân hủy dao động từ sau 5 ngày nuôi cấy. - Vì vậy, cả 3 hệ VSV này được sử dụng để phân lập VSV có khả năng phân hủy phenol.. - 3.2 Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy phenol từ mẫu bùn khu xả nước thải phòng thí nghiệm. - Từ ba hệ VSV có khả năng phân hủy phenol đã phân lập được 28 dòng VSV trong đó, 11 dòng VSV có nguồn gốc từ mẫu bùn Phòng thí nghiệm Hóa học. - (C) Tế bào nấm men hình bầu dục 3.3 Đánh giá khả năng phân hủy phenol. - 3.3.1 Khả năng phân hủy phenol của các dòng VSV tuyển chọn. - Sau 2 đợt bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng phân hủy phenol của 28 dòng VSV phân lập, kết quả cho thấy ở đợt bố trí thí nghiệm 1 (12 dòng VSV) vào thời điểm 2 ngày sau khi bố trí thí nghiệm 6 nghiệm thức chủng 6 dòng VSV có ký hiệu PS1.1, PS2, PS4.2, PS5, PS6 và ĐC5 có nồng độ phenol còn lại trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung phenol thấp hơn so với 6 nghiệm thức chủng 6 dòng VSV còn lại và cả nghiệm thức đối chứng. - Khi đó, nồng độ phenol của các nghiệm thức này lần lượt còn lại 11,8. - 10,1 và 9,33 mg.L -1 so với nồng độ bố trí ban đầu (500 mg.L-1) tương đương với hiệu suất phân hủy phenol dao động trong khoảng từ 97,6 đến 98,2. - khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng và các dòng VSV còn lại. - Trong khi đó, 6 nghiệm thức chủng 6 dòng VSV còn lại ký hiệu PH11, PH10, PH11, ĐC1.1, ĐC1.2 và ĐC4 có khả năng phân hủy phenol thấp hơn. - Nồng độ phenol còn lại trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung phenol của các nghiệm thức chủng các dòng VSV này lần lượt đạt và 419 mg.L -1 tương ứng với hiệu suất phân hủy phenol của các dòng VSV này dao động trong khoảng từ 13,3 % đến 86,2. - Ở đợt bố thí nghiệm 2 (16 dòng VSV) vào thời điểm 2 và 3 ngày sau khi bố trí thí nghiệm, nghiệm thức. - chủng dòng VSV có ký hiệu PS4.1 có nồng độ phenol còn lại trong môi trường khoáng tối thiểu loảng bổ sung phenol thấp hơn so với 15 nghiệm thức chủng 15 dòng VSV còn lại và cả nghiệm thức đối chứng, khi đó, nồng độ phenol còn lại của nghiệm thức này lần lượt đạt 35 và 4,51 mg.L -1 so với nồng độ bố trí ban đầu (500 mg.L -1 ) tương đương với hiệu suất phân hủy phenol 92,9 và 99. - khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng và các dòng VSV còn lại sau 2 và 3 ngày thí nghiệm. - Trong khi đó, 15 nghiệm thức còn lại chủng 15 dòng VSV còn lại có ký hiệu PH2, PH3, PH4, PH5, PH6, PH7, PH8, PH9, PS1.2, PS3, ĐC2, ĐC3, ĐC6, ĐC7 và ĐC8 có khả năng phân hủy phenol thấp hơn. - Nồng độ phenol còn lại trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung phenol của các nghiệm thức chủng các dòng VSV này lần lượt còn lại dao động trong khoảng từ 159 đến 289 mg.L -1 tương ứng với hiệu suất phân hủy phenol của các dòng VSV này dao động trong khoảng từ 36,6 % đến 66,9 % sau 3 ngày nuôi cấy.. - Vì vậy sau hai đợt bố trí thí nghiệm 7 dòng VSV có ký hiệu: PS1.1, PS2, PS4.1, PS4.2, PS5, PS6 và ĐC5 thể hiện khả năng phân hủy phenol cao nhất được tuyển chọn để bố trí thí nghiệm chung với nhau trong cùng một điều kiện thí nghiệm giúp dễ dàng so sánh khả năng phân hủy phenol của 7 dòng VSV này. - Điều này cho thấy tại khu vực phơi nhiễm với phenol cao như khu xả nước thải phòng thí nghiệm có nhiều dòng VSV có khả năng phân hủy phenol cao. - Ngoài ra, trong môi trường đất cỏ vẫn có sự hiện diện của VSV có khả năng phân hủy phenol tốt.. - Kết quả khảo sát khả năng phân hủy phenol của 7 dòng VSV được tuyển chọn và hệ VSV có nguồn gốc từ mẫu bùn ao chứa nước thải phòng thí nghiệm sinh học đất trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung phenol sau 5 ngày bố trí thí nghiệm được trình bày ở Hình 3. - Kết quả cho thấy giữa các nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa thống kê về khả năng phân hủy phenol theo thời gian thí nghiệm và nồng độ phenol còn lại trong môi trường nuôi cấy lỏng giảm rất nhanh trong thời gian thí nghiệm, ngoại trừ nghiệm thức đối chứng không chủng VSV.. - Vào thời điểm 1 ngày thí nghiệm, các nghiệm thức chủng VSV và nghiệm thức đối chứng có nồng. - Nồng đô phenol ở các nghiệm thức dao động từ 461 đến 498 mg.L -1. - Ở thời điểm 2 ngày thí nghiệm, nồng độ phenol còn lại trong môi trường nuôi cấy của nghiệm thức chủng dòng VSV PS6 là 351 mg.L -1 (chiếm tỉ lệ 32,2. - hiệu suất phân hủy phenol), thấp nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức chủng VSV còn lại và nghiệm thức đối chứng (p<0,05).. - Trong đó, nồng độ phenol của các nghiệm thức được chủng với VSV còn lại dao động từ 374 đến 476 mg.L -1 . - Ngoài ra, nghiệm thức chủng hệ VSV từ mẫu bùn thải phòng thí nghiệm sinh học đất (HPS) có khả năng phân hủy phenol thấp hơn so với nghiệm thức chủng dòng VSV PS6 với nồng độ phenol còn lại là 383 mg.L -1 và đạt 27,1 % hiệu suất phân hủy phenol (p<0,05).. - Hình 3: Diễn biến về nồng độ phenol còn lại trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng của các nghiệm thức thí nghiệm (n =3, độ lệch chuẩn). - HPS: hệ VSV từ mẫu bùn Phòng thí nghiệm Sinh học đất Vào thời điểm 3 ngày thí nghiệm, nghiệm thức. - Ngoài ra, nghiệm thức chủng hệ VSV từ mẫu bùn phòng thí nghiệm sinh học đất. - Ở thời điểm 5 ngày thí nghiệm, các nghiệm thức có chủng các dòng VSV đơn lẻ và hệ VSV đều có nồng độ phenol còn lại trong môi trường lỏng rất thấp. - Đặc biệt, nghiệm thức được chủng với dòng PS1.1 và PS6 có nồng độ phenol trong môi trường. - Tóm lại, hai dòng vi sinh vật ký hiệu PS1.1 và PS6 có tiềm năng ứng dụng cao trong việc phân hủy phenol.. - Các nghiên cứu trước đây cũng cho thấy có nhiều nhóm VSV có khả năng phân hủy phenol cao.. - thể hiện khả năng phân hủy phenol trong môi trường khoáng tối thiểu với hiệu suất phân hủy phenol đạt 100 % sau 7 ngày thí nghiệm với nồng độ bố trí ban đầu (400 mg.L -1. - VTPG5 (LC057207) khi phát triển trong điều kiện tối ưu dòng vi khuẩn này tạo ra biofilm giúp gia tăng hiệu suất phân hủy lên đến 99,8 % sau 7 ngày nuôi cấy với hàm lượng ban đầu 200 mg.L -1 (Lê Thị Nhi Công và ctv., 2016).. - Ngoài vi khuẩn, nấm men cũng có khả năng phân hủy phenol rất cao. - Candida subhashii, Candida oregonensis và Schizoblastosporion starkeyi-henricii có khả năng phân hủy phenol rất cao trong thời gian ngắn, cụ thể Candida subhashii và Schizoblastosporion starkeyi- henriciin có khả năng làm giảm nồng độ phenol đến 1000 mg.L -1 trong 2 ngày nuôi cấy. - Riêng loài Candida oregonensis có khả năng làm giảm nồng độ phenol từ 500 - 750 mg.L -1 trong 2 ngày nuôi cấy.. - có khả năng làm giảm nồng độ phenol đến 500 mg.L -1 trong 2 ngày nuôi cấy. - (2006) cho thấy dòng nấm men Candida tropicalis – P4 có khả năng phân hủy 1000 ppm phenol trong 3 ngày và dòng nấm men Candida tropicalis – P2 có khả năng phân hủy 1000 ppm phenol trong 4 ngày.. - Mật số VSV của các nghiệm thức theo thời gian thí nghiệm được trình bày trong Hình 4 cho thấy có sự gia tăng về mật số VSV của các nghiệm thức chủng VSV trong môi trường nuôi cấy trong suốt 5 ngày thí nghiệm. - Mật số VSV của các nghiệm thức chủng VSV tăng rất nhanh ở giai đoạn 1-3 ngày thí nghiệm, sau đó, tăng chậm lại và có xu hướng ổ định ở giai đoạn 3-5 ngày sau thí nghiệm. - Hình 4: Diễn biến mật số VSV trong môi trường nuôi cấy lỏng bổ sung phenol của các nghiệm thức thí nghiệm (n = 3, độ lệch chuẩn). - Vào thời điểm 1 ngày sau khi bố trí thí nghiệm, mật số VSV tăng rất nhanh so với thời điểm 0 ngày bố trí thí nghiệm, nghiệm thức chủng hệ VSV từ mẫu bùn phòng thí nghiệm sinh học đất và dòng VSV ký hiệu ĐC5 có mật số VSV lần lượt là 10 6 và 10 5 CFU.mL -1 , cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p<0,05), điều này có thể là do vào thời điểm này vi sinh vật bắt đầu thích nghi và tiến hành nhân mật số rất nhanh trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung 500 mg.L -1 phenol. - Các nghiệm thức còn lại có mật số VSV dao động từ CFU.mL -1 . - Nghiệm thức chủng dòng VSV ký hiệu PS4.1 có mật số thấp nhất (10 2 CFU.mL -1. - Vào thời điểm 2 ngày sau khi thí nghiệm, mật số VSV của các nghiệm thức chủng VSV bắt đầu tăng nhanh, trong đó, nghiệm thức có chủng hệ VSV từ mẫu bùn phòng thí nghiệm sinh học đất (HPS) có mật số VSV đạt 10 8 CFU.mL -1 (p<0,05). - Kế đến, các nghiệm thức chủng các dòng VSV ký hiệu PS1.1, ĐC5 và PS6 có mật số VSV đều đạt 10 6 CFU.mL -1 , cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức có chủng các dòng vi sinh vật còn lại (p<0,05).. - Vào thời điểm 3 ngày sau khi thí nghiệm, mật số VSV của các nghiệm thức chủng VSV tiếp tục tăng lên cao, trong đó, nghiệm thức chủng dòng VSV ký hiệu PS1.1, PS4.1, PS6 và ĐC5 có mật số VSV cao hơn so với 3 nghiệm thức chủng 3 dòng VSV còn lại. - nghiệm thức còn lại (p<0,05). - Bên cạnh đó, mật số VSV ở nghiệm thức chủng hệ VSV từ mẫu bùn phòng thí nghiệm sinh học đất (HPS) đạt cao nhất (đạt 10 9 CFU.mL -1. - Vào thời điểm 5 ngày sau khi thí nghiệm mật số của các nghiệm thức có chủng các dòng VSV và hệ VSV đạt trạng thái ổn định và khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức.. - Mật số VSV của nghiệm thức có chủng hệ VSV bùn phòng thí nghiệm sinh học (HPS) tăng nhanh, và cao hơn so với các nghiệm thức chủng các dòng VSV đơn giai đoạn từ 0 đến 3 ngày sau khi bố trí.. - Tuy nhiên, khả năng phân hủy phenol của hệ VSV bùn phòng thí nghiệm sinh học (HPS) thấp hơn so với dòng VSV đơn. - Điều này cho thấy trong hệ VSV có một số dòng cơ hội, chỉ hưởng lợi từ hoạt động phân hủy phenol của nhóm VSV phân hủy phenol mà không thể phân hủy phenol.. - Mẫu bùn Phòng thí nghiệm Sinh học đất. - Cả ba hệ VSV có nguồn gốc từ đất bùn từ ao chứa nước xả thải Phòng thí nghiệm Sinh học đất, Phòng thí nghiệm Hóa học đất và đất trồng cỏ thuộc Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ có chứa nguồn vi sinh vật có khả năng phân hủy phenol cao sau 5 thế hệ nhân nuôi sinh khối liên tục trong phòng thí nghiệm trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng bổ sung phenol với nồng độ 500 mg.L -1 với hiệu suất phân hủy phenol dao động từ 87,6 % đến 91,5 % sau 5 ngày nuôi cấy. - VSV được phân lập từ 3 cộng đồng VSV này có sự đa dạng cao về hình thái khuẩn lạc, tế bào và khả năng phân hủy phenol với hiệu suất phân hủy phenol dao động từ 16,9 % đến 99,8 % ở thời điểm 5 ngày sau khi nuôi cấy. - Ngoài ra, các dòng VSV đơn có khả năng phân hủy phenol cao hơn so với hệ VSV từ bùn chứa nước thải phòng thí nghiệm sinh học đất (HPS). - Hai dòng nấm men ký hiệu PS1.1 và PS6 có khả năng phân hủy phenol cao nhất với hiệu suất phân hủy phenol lần lượt đạt 98,9 % và 97,6 % sau 5 ngày nuôi cấy và được định danh như là Candida tropicalis PS1.1 và Candida tropicalis PS6. - Phân loại chủng vi khuẩn BTLD1 có khả năng phân hủy phenol bằng phương pháp phân tích trình tự nuclleotit của đoạn gen 16s rARN. - Một số yếu tố sinh lý sinh hóa ảnh hưởng tới khả năng tạo màng sinh học chủng nấm men Trichosporon asahii QN – B1 phân hủy phenol phân lập từ Hạ Long, Quảng Ninh.