- PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH VI KHUẨN NỘI SINH. - TRONG RỄ CÂY KHOAI LANG (Ipomoea batatas) TRỒNG TRÊN ĐẤT PHÈN Ở HUYỆN HÒN ĐẤT, TỈNH KIÊN GIANG. - Cây khoai lang, cố định đạm, hòa tan lân, IAA, siderofores, vi khuẩn nội sinh. - Ba mươi sáu dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường LGI từ các mẫu rễ cây khoai lang trồng ở huyện Hòn Đất, tỉnh Kiên Giang. - Tất cả các dòng vi khuẩn này đều có dạng hình que và có khả năng chuyển động.. - Thực hiện các phép thử sinh hóa đã xác định được các dòng KL9, KL11, KL39a, KL39b là các vi khuẩn nội sinh có đủ 3 đặc tính tốt là cố định đạm, hòa tan lân khó tan, tổng hợp IAA. - Ba dòng KL9, KL39a, KL39b còn có khả năng sản xuất siderofores. - Khi giải trình tự đoạn gen 16S-DNA của 4 dòng vi khuẩn này, nhận diện được dòng KL9 có tỉ lệ đồng hình của đoạn gen 16S-DNA với loài Burkholderia sprentiae và Burkholderia vietnamiensis là 99%. - Bốn dòng vi khuẩn có các đặc tính tốt này được đề nghị đưa vào sản xuất phân vi sinh cho cây khoai lang trồng trên đất phèn vùng Hòn Đất.. - Khoai lang (Ipomoea batatas) là cây lương thực được trồng từ lâu đời, có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới Nam Mỹ. - Hiện nay, khoai lang được trồng rộng khắp trong các khu vực nhiệt đới và ôn đới ấm với lượng nước đủ để hỗ trợ sự phát triển của nó (Thái Hà và Đặng Mai, 2011). - Khoai lang là cây dễ nhân giống, sức sống mạnh, phát triển tốt trong đất cằn cỗi và nghèo nitơ. - Ở nước ta, khoai lang là một trong ba loại cây lương thực hàng đầu và được trồng ở cả ba miền. - Theo thống kê năm 2000 tổng diện tích khoai lang cả nước đạt 269.000 ha với năng suất 1.745.300 tấn, trong đó Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) luôn dẫn đầu về năng suất (Mai Thạch Hoành và Nguyễn Công Vinh, 2003). - Theo thống kê của ngành Nông nghiệp năm 2012 các tỉnh ĐBSCL tăng diện tích trồng khoai lang lên 21.500 ha, nhiều nhất là Vĩnh Long, Đồng Tháp, Kiên Giang, Cần Thơ, Trà Vinh.. - Khoai lang dùng làm lương thực cho người, thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu chế biến tinh bột, rượu, cồn, xi rô, nước giải khát, bánh kẹo, mì, miến, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học. - Khoai lang chế biến đem lại doanh thu cao, góp phần nâng tầm sản xuất khoai lang thành một sản phẩm nông nghiệp xanh trong cơ cấu nền nông nghiệp hàng hóa và phát triển bền vững. - Ở Kiên Giang, cây khoai lang đã đóng góp một phần đáng kể vào GDP của tỉnh.. - Theo số liệu của Cục Thống kê tỉnh Kiên Giang năm 2010, tổng diện tích sản xuất khoai lang của tỉnh là 1.543 ha tập trung ở các huyện Giồng Riềng, Hòn Đất và rải rác ở các huyện khác trong tỉnh. - Trong đó, Hòn Đất là huyện có vùng sản xuất khoai lang chuyên canh lớn nhất trong tỉnh với tổng diện tích sản xuất là 412 ha, tập trung ở các xã Mỹ Thái, Nam Thái Sơn, Mỹ Hiệp Sơn, Mỹ Thuận và riêng xã Mỹ Hiệp Sơn diện tích sản xuất khoai lang tập trung chủ yếu ở trang trại Ba Hạo.. - Để có đủ sản lượng khoai lang đáp ứng nhu cầu trong nước và thế giới, tại vùng trồng khoai lang chuyên canh nông dân đã sử dụng một lượng lớn phân hóa học. - Theo tính toán trung bình trên mỗi ha trồng trọt, để đạt năng suất 50 tấn/ha, khoai lang lấy từ đất khoảng 350 kgN-63 kgP-636 kgK cùng với các nguyên tố trung và vi lượng (Mai Thạch Hoành và Nguyễn Công Vinh, 2003). - cao, gây ô nhiễm môi trường và nghiêm trọng hơn là lượng hóa chất dư thừa sẽ tích lũy trong cây, tác động xấu đến sức khỏe con người và làm suy thoái hệ sinh thái nông nghiệp (Lê văn Khoa và Trần Bá Linh, 2013). - Mục tiêu đề tài (i) Phân lập một số dòng vi khuẩn nội sinh trong rễ cây khoai lang trồng trên đất phèn ở huyện Hòn Đất, tỉnh Kiên Giang (ii) Xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được (iii) Xác định khả năng sản xuất siderofores của dòng vi khuẩn có cả 3 đặc tính: cố định đạm, hòa tan lân khó tan, tổng hợp IAA, (iv) Nhận diện một vài dòng vi khuẩn nội sinh có các đặc tính tốt bằng kỹ thuật PCR.. - Bảy mươi lăm mẫu đất và mẫu rễ củ khoai lang (thuộc nhiều giống khoai đang trồng) tại các xã Mỹ Thuận, Mỹ Hiệp Sơn, Mỹ Thái, Sơn Kiên, Nam Thái Sơn (mỗi xã thu tại 3 ấp và mỗi ấp thu 5 mẫu đất và rễ) thuộc huyện Hòn Đất, tỉnh Kiên Giang;. - đất trồng khoai lang có lý hóa tính thuộc nhóm đất phèn nhẹ (pH thấp, P dễ tiêu thấp trừ mẫu đất ở xã Sơn Kiên) nhưng N tổng số rất cao (Bảng 1).. - 2.2 Phân lập vi khuẩn. - Để kiểm tra khả năng các vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trùng, 200 μl nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần cuối được chủng lên các đĩa môi trường tryptone – yeast extract – glucose – agar và ủ ở 30ºC, nếu sau 24 giờ ủ các đĩa môi trường này không có các khuẩn lạc xuất. - Lấy 200 μl dịch mẫu nghiền cho vào các ống nghiệm chứa 3 ml môi trường LGI (Cavalcante và Dobereiner, 1988) rồi đem ủ ở 30ºC trong 2 - 3 ngày. - Bảng 1: Thành phần hóa lý tính của đất (phèn) trồng khoai lang ở các xã thuộc huyện Hòn Đất, tỉnh Kiên Giang. - Xã Mỹ Hiệp Sơn Xã Nam Thái Sơn Sau 2 - 3 ngày nuôi, quan sát thấy các ống nghiệm chứa các môi trường bán đặc LGI, đã chủng dịch trích của mẫu xuất hiện một lớp màng mỏng cách mặt môi trường nuôi khoảng 0,5 cm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh. - Lấy một ít vi khuẩn từ các màng mỏng của các môi trường bán đặc LGI, lần lượt cấy chuyển sang các đĩa môi trường LGI đặc để tách dòng các khuẩn lạc. - Sau vài lần cấy chuyển trên các môi trường đặc, chọn các khuẩn lạc rời và đều nằm trên đường cấy quan sát dưới kính hiển vi. - Khi thấy vi khuẩn đã ròng (thuần nhất) thì cấy chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường đặc tương ứng để trữ ở 4ºC và được xem như là một dòng (chủng [isolate. - Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập đặc đồng thời đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. - 2.3 Tách chiết DNA vi khuẩn. - Để nhận diện vi khuẩn sống nội sinh trong cây, sử dụng các đoạn mồi 16S rDNA được thiết kế (Zinniel et al., 2002) với trình tự như đã trình bày theo Nguyễn Thị Thu Hà và ctv. - Vi khuẩn được nuôi trong môi trường Burk’s không có N đặc (Park et al., 2005) và định lượng ammonium hình thành trong mẫu bằng phương pháp Phenol Nitro-prusside sodium hypochloride để xác định hàm lượng NH 4 + được tạo ra bằng phản ứng so màu ở bước sóng 640 nm. - Vi khuẩn được nuôi trong môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999) và định lượng lân hòa tan bằng thuốc thử acid ascorbic - ammoniummolypdate - potassium antinomol tartrate và phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 880 nm. - Vi khuẩn được nuôi trong môi trường bổ sung 100 mg/l tryptophan và định lượng bằng thuốc thử Salkowski R2 và phương pháp so màu ở bước sóng 530 nm. - Đánh giá khả năng sản xuất siderophores Nhận diện hợp chất siderophores dựa theo phương pháp do Schwyn và Neilands (1987) mô tả bằng cách chuẩn bị môi trường chorome azurol S (CAS) agar, nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường PS, lắc 200 vòng trên phút, ở 30°C trong 24 giờ.. - Nhỏ giọt 50 μl dịch vi khuẩn trên môi trường chorome azurol (CAS) agar và ủ ở 30°C trong 48 giờ. - Khi vi khuẩn sử dụng sắt trong môi trường thì màu xanh của môi trường CAS xung quanh khuẩn lạc không còn nữa. - Sử dụng đoạn mồi 1 p515FPL trong phản ứng PCR để nhận diện vi khuẩn nội sinh đã mô tả ở phần trên. - Sử dụng chương trình BLAST N và Clustal W để so sánh trình tự các đoạn DNA của 3 dòng vi khuẩn với trình tự DNA của bộ gen ở các loài vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI) và vẽ cây phả hệ để định danh vi khuẩn.. - 3.1 Thu thập mẫu, phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn phân lập được. - Từ các mẫu rễ cây khoai lang trồng ở những vùng đặc trưng của Hòn Đất tỉnh Kiên Giang, qua các giai đoạn phân lập và tách ròng vi khuẩn trên môi trường LGI đã thu được 36 dòng vi khuẩn khác nhau. - Các dòng vi khuẩn phân lập được đều có chung đặc tính là sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí trong môi trường LGI bán đặc, tạo thành lớp màng mỏng (pellicle) cách bề mặt môi trường 2-6 mm (Hình 1), kết quả này phù hợp với báo cáo của Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thành Dũng (2010) và Nguyễn Thị Thu Hà và ctv.. - Lớp màng mỏng hình thành trong môi trường bán đặc này có màu hơi trắng hoặc hơi vàng (Perin et al., 2006).. - Hình 1: Vi khuẩn sau 4-6 ngày nuôi cấy trong môi trường LGI bán đặc. - 3.1.1 Đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập được Các đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập được mô tả sau 48 giờ cấy trên môi. - trường phân lập LGI. - Màu sắc khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được có màu trắng trong và trắng đục với tỉ lệ bằng nhau: trắng trong là 18 dòng, chiếm tỉ lệ 50% và trắng đục là 18 dòng, chiếm tỉ lệ 50%. - Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều tạo khuẩn lạc dạng tròn chiếm tỉ lệ 100%.. - Kích thước khuẩn lạc: Đường kính khuẩn lạc của 36 dòng vi khuẩn đã phân lập dao động từ 0,2-3,5 mm sau khi cấy trên môi trường đặc và ủ ở 30°C trong 24 giờ.. - 100% các dòng vi khuẩn phân lập được đều có dạng hình que và chuyển động trong đó vi khuẩn có dạng que ngắn chiếm phần lớn với 33/36 dòng chiếm tỉ lệ 91,7%. - vi khuẩn có dạng que dài chiếm số lượng rất ít với 3/36 dòng chiếm tỉ lệ 8,3%. - Tất cả 36 dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ cây khoai lang ở huyện Hòn Đất, tỉnh Kiên Giang đều có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA (Bảng 2). - Có 10/36 dòng cố định đạm cao đó là các dòng KL4, KL9, KL11, KL30a, KL32b, KL35b, KL36b, KL38, KL39a, KL39b.. - Dòng vi khuẩn hòa tan lân khó tan cao có 10/36 dòng đó là các dòng KL6, KL9, KL11, KL20b, KL30b, KL31, KL33, KL36a, KL39a, KL39b. - Có 9/36 dòng có khả năng tổng hợp IAA cao đó là các dòng KL9, KL30a, KL31, KL32a, KL11, KL20b, KL39a, KL39b KL42b.. - Hình 2: Dòng vi khuẩn KL9 ở độ phóng đại 6.000 lần và dòng vi khuẩn KL39b ở độ phóng đại 8.000 lần. - Bảng 2: Khả năng tổng hợp NH 4. - hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được. - Căn cứ vào kết quả khảo sát các đặc tính tốt của 36 dòng vi khuẩn (cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA), chọn 4 dòng có cả 3 đặc tính trên đó là dòng KL9, KL11, KL39a và KL39b tiếp tục khảo sát khả năng sản xuất siderophores và giải trình tự đoạn 16S-rDNA.. - Khả năng sản xuất siderophores. - Trong số bốn dòng vi khuẩn có 3 dòng tạo được. - vòng sáng và làm đổi màu môi trường CAS đó là dòng KL9, KL39a và KL39b với đường kính vòng sáng lần lượt là 1,8 cm, 2,5 cm và 2 cm (Hình 3);. - còn dòng KL11 không tạo vòng sáng trên môi trường CAS. - Như vậy, ngoài các đặc tính tốt như cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA thì các dòng KL9, KL39a và KL39b còn có khả năng đối kháng thông qua sự cạnh tranh Fe 3 + với các vi sinh vật gây bệnh.. - Hình 3: Khả năng sản xuất siderofores của các dòng vi khuẩn (mẫu chụp ngày Dòng vi khuẩn KL9. - (B) Dòng vi khuẩn KL39a. - Dòng vi khuẩn KL39. - 3.2 Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh bằng 16S rDNA. - Các dòng vi khuẩn KL9, KL11, KL39a, KL39b được ly trích DNA và tiến hành phản ứng PCR với 3 đoạn mồi 16S-rDNA (p515FPL, p13B và PCR-1) để nhận diện các dòng vi khuẩn này là vi khuẩn nội. - Kết quả cho thấy cả 4 dòng vi khuẩn trên đều cho bank DNA ở vị trí khoảng 900 bp so với thang chuẩn 100 bp-plus, phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước đây (Zinniel et al. - Hình 4: Phổ điện di DNA của các dòng vi khuẩn nội sinh 1: thang chuẩn 100 bp-plus;2: dòng KL9. - Kết quả giải trình tự và Blast các dòng vi khuẩn trên hàng gen của NCBI. - Từ kết quả thực hiện phản ứng PCR và điện di trên agarose 1,2%, các sản phẩm PCR được tiến hành giải trình tự để nhận diện các dòng vi khuẩn KL9, KL11, KL39a, KL39b. - Burkholderia vietnamiensis cũng được Ngô Thanh Phong và ctv (2010) phân lập và nhận diện trong đất vùng rễ lúa ở Kiên Giang và bằng phương pháp khử acetylen đã xác định khả năng cố định đạm của loài vi khuẩn này. - Dòng vi khuẩn. - Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae cũng được nhận diện là vi khuẩn nội sinh trong một số loài cỏ chăn nuôi (Nguyễn Thị Thu Hà et al. - Các dòng vi khuẩn này có khả năng cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan, tổng hợp IAA và đã được nghiên cứu để sản xuất phân hữu cơ-vi sinh bón cho cây khóm rất hiệu quả (Trần Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp, 2011). - Việc xác định trình tự gen nifH ở Klebsiella pneumoniae nội sinh trong cây khoai lang ở Châu Phi cho thấy khả năng cố định đạm của dòng vi khuẩn này (Reiter et al.. - Bảng 3: Mối liên hệ di truyền giữa 4 dòng vi khuẩn đã phân lập với các dòng vi khuẩn trong ngân hàng gene của NCBI trên cơ sở gene 16S-rDNA bằng phần mềm BLAST N. - Dòng vi khuẩn phân lập Dòng vi khuẩn đồng hình Tỉ lệ đồng hình. - HQ154568 Klebsiella pneumoniae strain R6-3A 99 Phân tích 4 chủng vi khuẩn này trong cây phả. - hệ cho thấy các dòng KL9, KL39b, KL11 cùng nằm trên một nhánh của cây phả hệ nên có mối quan hệ gần gũi với nhau về mặt di truyền (nhóm. - Dòng KL39a ở một nhánh riêng trên phả hệ (nhóm B) chứng tỏ dòng này không có quan hệ gần gũi với các dòng trên. - Hình 5: Cây phả hệ trình bày mối liên hệ di truyền của 4 dòng vi khuẩn với nhau dựa vào trình tự gene 16S-rDNA bằng phần mềm MEGA 6.06 (phương pháp Maximum -likelihood với 1500 lần lặp lại. - Ba mươi sáu dòng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu rễ cây khoai lang trồng trên đất phèn ở huyện Hòn Đất, tỉnh Kiên Giang. - Các dòng vi khuẩn này đều có khả năng tổng hợp ammonium, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA. - Ba dòng KL9, KL39a và KL39b còn có khả năng sản xuất siderophores.. - Bằng kỹ thuật giải trình tự đoạn 16S-rDNA các dòng vi khuẩn KL9, KL39a, KL39b, KL11 tương đồng với các dòng Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia sprentiae, Burkholderia ambifaria, Enterobacter ludwigii, Enterobacter cloaca và Klebsiella pneumoniaeở mức độ 99%.. - Xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan, tổng hợp IAA và sản xuất siderophores của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây khoai lang ở điều kiện nhà lưới hay ngoài đồng.. - Đặc tính vi khuẩn nội sinh phân lập trong cây khóm trồng trên đất phèn Vĩnh. - Phân lập và nhận. - diện vi khuẩn cố định đạm vùng rễ lúa trồng trên đất phù sa tỉnh Kiên Giang. - Phân lập và đặc tính của những dòng vi khuẩn nội sinh trong một số cây cỏ chăn nuôi. - Kỹ thuật trồng và chăm sóc khoai lang