- QUI TRÌNH RT-PCR PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HOẠI TỬ CƠ. - A RT-PCR protocol for the detection of infectious myonecrosis virus (IMNV) in Penaeus vannamei. - RT-PCR, IMNV, Penaeus vannamei, phát hiện Keywords:. - Nghiên cứu đã xác định được qui trình PCR với thành phần hóa chất, điều kiện chu kỳ nhiệt thích hợp để phát hiện virus gây hoại tử cơ trên tôm thẻ chân trắng. - Nghiên cứu tập trung tối ưu hóa bước 2 của qui trình với các thành phần phản ứng được xác định bao gồm đệm PCR 1X. - Điều kiện nhiệt độ bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 95 o C trong 2 phút tiếp theo 35 chu kỳ 95 o C trong 30 giây, 65 o C trong 20 giây, 72 o C trong 30 giây, 72 o C trong 7 phút. - Tổng số thời gian khuếch đại là khoảng 2 giờ. - Độ nhạy và độ chuyên biệt của phản ứng phát hiện IMNV cho kết quả tốt với các mẫu ARN chiết tách từ tôm.. - Theo tổ chức thú y thế giới, IMNV đã được phát hiện ở nhiều nước châu Á như Indonesia, Thái Lan và Trung Quốc, nguyên nhân là do sự nhập chuyển tôm bố mẹ mang mầm bệnh. - Hiện nay, bệnh vẫn chưa có thuốc chữa trị nên việc phòng ngừa và phát hiện bệnh sớm là cần thiết (Senapin et al., 2007. - Theo báo cáo này, khu vực châu Á chỉ có Indonesia là quốc gia duy nhất phát hiện có sự tồn tại của IMNV và IMNV gây thiệt hại cho nghề nuôi tôm chân trắng của quốc gia này. - Ngoài Indonesia, thông tin về sự tồn tại của IMNV trong mẫu tôm thẻ có hiện tượng đục cơ từ các quốc gia khác thuộc khu vực châu Á đều có thể chỉ là tin đồn và chưa xác thực (Senapin et al., 2011).. - Trong nhiều năm qua đã có nhiều phương pháp được ứng dụng để phát hiện IMNV, trong đó phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) là phương pháp được ứng dụng rộng rãi, cho kết quả nhanh chóng và đáng tin cậy (Lightner et al., 2004). - Do vậy, nghiên cứu được thực hiện nhằm ứng dụng qui trình RT-PCR phát hiện Infectious myonecrosis virus-IMNV trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) nuôi ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long.. - Ứng dụng và phát triển qui trình RT-PCR có độ nhạy và tính chuyên biệt cao giúp phát hiện IMNV ở giai đoạn sớm và phù hợp cho việc phát hiện kiểu gen IMNV phân lập ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long.. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chiết tách ARN. - ARN tổng số chiết tách từ mẫu tôm (10-20 mg. - mang tôm) với dung dịch Trizol theo qui trình hướng dẫn của nhà sản xuất (Life Technologies, GIBCO BRL). - Hàm lượng ARN chiết tách được xác định bằng phương pháp so màu quang phổ ở bước sóng 260 nm, 280 nm và chất lượng ARN chiết tách được đánh giá qua tỉ lệ 260/280 nm.. - 2.2.2 Tổng hợp cDNA. - Tiếp theo, trộn hỗn hợp B vào hỗn hợp A và thực hiện các điều kiện phản ứng như sau: 25 0 C trong 7 phút;. - 2.2.3 RT-PCR phát hiện IMNV. - Nghiên cứu thử nghiệm qui trình RT-PCR sử dụng các đoạn mồi 4587 F, 4914 R, 4725 NF, 4863 NR (OIE, 2009) để phát hiện IMNV (Bảng 1). - Để phát hiện IMNV, cần thực hiện qui trình khuếch đại cDNA bao gồm 2 bước:. - Khuếch đại bước 1 được thực hiện với thành phần hóa chất bao gồm: 1X PCR buffer. - (ii) Chu kì nhiệt của phản ứng với giai đoạn đầu 95ºC trong 2 phút, tiếp theo là lặp lại 39 lần với 95ºC trong 30 giây, 65ºC trong 30 giây, 72ºC trong 30 giây, và giai đoạn kéo dài 72ºC trong 2 phút.. - Khuếch đại bước 2 được thực hiện với thành phần hóa chất bao gồm: 1X PCR buffer. - (ii) Chu kì nhiệt của phản ứng với giai đoạn đầu 95ºC trong 2 phút, tiếp theo là lặp lại 35 lần với 95ºC trong 30 giây, 65ºC trong 20 giây, 72ºC trong 30 giây, và giai đoạn kéo dài 72ºC trong 7 phút.. - Bảng 1: Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR. - CGA-CGC-TGC-TAA-CCA-TAC-AA ACT-CGG-CTG-TTC-GAT-CAA-GT GGC-ACA-TGC-TCA-GAG-ACA AGC-GCT-GAG-TCC-AGT-CTT-G Sản phẩm PCR được điện di bằng gel agarose. - Căn cứ vào thang ADN 100 bp (Promega) để xác định trọng lượng phân tử của mẫu phân tích.. - Kết quả được ghi nhận vạch ở vị trí 328 bp là mẫu nhiễm IMNV (sản phẩm PCR bước 1) hay vạch ở vị trí 139 bp là mẫu nhiễm IMNV (sản phẩm PCR bước 2).. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. - 3.1 Xác định khả năng ứng dụng của các đoạn mồi phát hiện IMNV (OIE, 2009). - Mẫu tôm nhiễm IMNV (Viện 2) được chiết tách và thực hiện quy trình RT-PCR phát hiện IMNV (OIE, 2009). - Mẫu ARN chiết tách, xác định hàm lượng, tổng hợp cDNA với mồi Randome Hexamers và khuếch đại cDNA theo quy trình được mô tả ở mục 2.2. - Qui trình được thực hiện và chuẩn hóa ở: (i) thành phần tham gia phản ứng bao gồm các chỉ tiêu: giảm nồng độ Taq (giảm từ 2,5U/phản ứng và cho sản phẩm khuyếch đại rõ ở nồng độ 2,0U/phản ứng), giảm nồng độ MgCl 2. - (ii) điều kiện phản ứng PCR bước 2 bao gồm: giảm số chu kỳ phản ứng từ 39 chu kỳ xuống còn 35 chu kỳ và tăng thời gian tổng hợp của bước kéo dài từ 2 phút lên 7 phút. - Sau khi thực hiện các bước chuẩn hóa, qui trình khuếch đại RT-PCR phát hiện IMNV được thực hiện và cho kết quả ghi nhận ở Hình 1.. - Hình 1: Kết quả thực hiện quy trình RT-PCR phát hiện IMNV. - Giếng 1: Thang 100bp DNA (Promega) Giếng 2: Sản phẩm PCR bước 2. - Kết quả ở Hình 1 cho thấy sản phẩm điện di hiện vạch rõ ở 139bp, là vạch sản phẩm của IMNV. - và không có sản phẩm không đặc hiệu. - Điều này cho thấy ảnh hưởng của các yếu tố như nồng độ Taq, nồng độ MgCl 2, số chu kỳ phản ứng và thời gian tổng hợp của bước kéo dài đến khả năng khuếch đại của qui trình. - (iii) số lượng chu kỳ lặp lại nhiều lần làm tăng lượng sản phẩm không đặc hiệu. - (iv) số lượng chu kỳ có quá ít lần lặp lại tạo ra ít sản phẩm (Innis and H.. - Sự thay đổi điều chỉnh các chỉ tiêu này đã giúp tạo sản phẩm khuếch đại sáng và rõ.. - Qui trình được khảo sát thêm một số chỉ tiêu cơ bản về độ nhạy và tính đặc hiệu để tìm hiểu về khả năng ứng dụng của qui trình.. - Xác định độ nhạy của quy trình RT-PCR phát hiện IMNV. - Để có thể xác định độ nhạy của phản ứng, qui trình được thử nghiệm với một mẫu được pha loãng ở các hàm lượng RNA khác nhau. - Một mẫu chiết tách được pha loãng để có các mẫu lần lượt tương ứng với các hàm lượng RNA là 100 ng/μl, 10 ng/μl, 1 ng/μl, 100 pg/μl, 10 pg/μl.. - Kết quả hiện vạch sáng ở 139bp điều đó cho thấy có sự có mặt của IMNV trong các mẫu (Hình 2). - Mẫu cho vạch sản phẩm khuếch đại ở các nồng độ pha loãng 200 ng/µl, 100 ng/µl và 10 ng/µl trong khi đó ở các nồng độ pha loãng thấp hơn không hiện vạch. - So với qui trình RT-PCR phát hiện IMNV của Poulos and Lighner (2006), với khả năng phát hiện khoảng 100 bản sao của virus cho bước 1 và 10 bản sao virus cho bước 2. - Kết quả về khả năng phát hiện của qui trình này cho nồng độ phát hiện thấp hơn. - Nguyên nhân là do qui trình RT-PCR phát hiện IMNV của Poulos and Lighner (2006) sử dụng mẫu chiết tách ARN từ thể virion tinh sạch (RNA extracted from purified virions). - Theo Nguyễn Văn Thanh (2007) nồng độ DNA khuôn ảnh hưởng đáng kể đến quá trình khuếch đại của PCR. - Như vậy, quy trình OIE (2009) vừa được ứng dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm của Khoa cho phép phát hiện IMNV ở nồng độ 10 ng/µl.. - Hình 2: Xác định độ nhạy của quy trình PCR khi pha loãng RNA ở các nồng độ khác nhau Giếng 1: thang DNA 100bp. - Giếng 3: pha loãng RNA ở nồng độ 200 ng/µl Giếng 4: pha loãng RNA ở nồng độ 100 ng/µl Giếng 5: pha loãng RNA ở nồng độ 10 ng/µl Giếng 6: pha loãng RNA ở nồng độ 1 ng/µl Giếng 7: pha loãng RNA ở nồng độ 100 pg/µl Giếng 8: pha loãng RNA ở nồng độ 10 pg/µl. - Xác định tính chuyên biệt của quy trình RT- PCR. - Tính đặc hiệu của qui trình RT-PCR phát hiện IMNV được kiểm tra với các loại virus phổ biến trên tôm. - Trong đó, quy trình RT-PCR khuếch đại virus thuộc nhóm ADN mạch đôi (White spot syndrome virus - WSSV), ADN mạch đơn. - (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus - IHHNV) và virus thuộc nhóm ARN (Gill- associated virus - GAV, Taura syndrome virus- TSV) (Lightner, 1996) để xác định tính chuyên biệt. - Kết quả điện di xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR phát hiện IMNV thể hiện qua Hình 3.. - Hình 3: Kết quả kiểm tra tính chuyên biệt của quy trình RT-PCR với WSSV, IHHNV, TSV, GAV Giếng 1: đối chứng âm. - Kết quả Hình 3 cho thấy chỉ có mẫu tôm có nhiễm IMNV. - hiện vạch sáng ở mức 139bp (Giếng 2) trong khi các mẫu tôm nhiễm WSSV (Giếng 4), IHHNV (Giếng 5), TSV (Giếng 6), GAV (Giếng 7) đều cho kết quả âm tính. - Qua đó cho thấy cặp mồi sử dụng trong quy trình phát hiện IMNV (OIE, 2009) chuyên biệt với IMNV.. - Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của qui trình cho thấy qui trình chỉ phát hiện được IMNV mà không phát hiện được các virus khác nhiễm phổ biến trên tôm khi sử dụng các cặp mồi 4587 F, 4914 R. - 4725 NF, 4863 NR (OIE, 2009) cho qui trình. - Kết quả đạt được cũng tương tự như kết quả khảo sát của Poulos and Lighner (2006) khi sử dụng các cặp mồi này khuếch đại các virus thường gặp trên tôm biển (TSV, IHHNV, WSSV). - Kết quả ghi nhận là qui trình không tạo ra bất kỳ sản phẩm khuếch đại. - từ các mẫu axít nucleic chiết tách từ các virus trên.. - Như vậy, các cặp mồi sử dụng trong qui trình RT- PCR phát hiện IMNV có tính đặc hiệu chỉ cho phép khuếch đại gen của virus gây hoại tử cơ trên tôm.. - 3.2 Xác định khả năng ứng dụng của qui trình với một số mẫu tôm thẻ chân trắng với quy trình RT-PCR (OIE, 2009) đã được tối ưu. - Để xác định khả năng ứng dụng của quy trình RT-PCR, năm mẫu tôm được thu từ hai tỉnh Cà Mau và Bạc Liêu ở Đồng bằng sông Cửu Long và một mẫu cDNA của IMNV được tổng hợp từ mẫu tôm nhiễm IMNV thu ở Thái Lan được sử dụng để kiểm tra khả năng ứng dụng của quy trình. - Các mẫu tôm này được chẩn đoán có dấu hiệu của bệnh lý của bệnh IMN (có hiện tượng tôm chết trong ao, tôm có dấu hiệu đục cơ ở phần bụng).. - Hình 4: Khuếch đại PCR từ các mẫu tôm được chiết tách Giếng 1: Thang DNA 100bp. - Giếng 4 đến Giếng 5: mẫu tôm P. - vannamei thu tại Bạc Liêu Giếng 6 đến Giếng 8: mẫu tôm P. - Mẫu tôm có dấu hiệu đục cơ được sử dụng chiết tách ARN và khuếch đại với qui trình RT- PCR phát hiện IMNV vừa được tối ưu. - Kết quả qui trình RT-PCR cho các sản phẩm khuếch đại ở mức 139bp. - Kết quả điện di ở Hình 4 cho thấy: giếng 2 (đối chứng âm) không hiện vạch sản phẩm, giếng 3 (đối chứng dương – mẫu cDNA của IMNV được tổng hợp từ mẫu tôm nhiễm IMNV thu ở Thái Lan) cho kết quả dương tính, giếng 4 –giếng 8 (mẫu tôm thu ở Cà Mau và Bạc Liêu) cho kết quả dương tính.. - Các kết quả ghi nhận được cho thấy: (i) Các cặp mồi có tính chuyên biệt khi khuếch đại đúng đoạn DNA của IMNV. - (ii) Khả năng phát hiện các mẫu IMNV nhiễm ở tôm. - Như vậy, qui trình RT- PCR phát hiện IMNV vừa được tối ưu có thể ứng dụng trong việc chẩn đoán tôm bị nhiễm virus này.. - Qui trình RT-PCR được phát triển phù hợp với điều kiện thực tế với các thay đổi về thành phần hoá chất tham gia phản ứng và chu kỳ nhiệt của . - phản ứng. - Kết quả bước đầu ghi nhận khả năng sử dụng tốt của qui trình RT-PCR trong việc phát hiện IMNV từ mẫu tôm nhiễm IMNV – mẫu đối chứng của Thái Lan, với độ nhạy khoảng 10 ng/µl và thời gian khuếch đại ngắn (2 giờ). - Qui trình có thể ứng dụng để xét nghiệm phát hiện IMNV trên tôm giống hoặc tôm bố mẹ.. - Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng. - Infectious myonecrosis:. - Detection of infectious myonecrosis virus (IMNV) of penaeid shrimp by reverse- transcriptasepolymerase chain reaction (RT- PCR). - Senapin S, Phewsaiya K, Briggs M, Flegel TW (2007) Outbreaks of infectious myonecrosis virus (IMNV) in Indonesia confirmed by genome sequencing and use of an alternative RT-PCR detection method.