Tuyển chọn dòng nấm mốc Aspergillus niger sinh tổng hợp protease hoạt tính cao

- TUYỂN CHỌN DÒNG NẤM MỐC Aspergillus niger SINH TỔNG HỢP PROTEASE HOẠT TÍNH CAO Trần Thanh Trúc và Nguyễn Văn Mười.
- Aspergillus niger, đường kính vòng thủy phân casein, hoạt tính cao, protease.
- Kết quả cho thấy tất cả các dòng nấm khảo sát đều có khả năng tiết ra protease khi phát triển trên môi trường agar – casein.
- Trong đó, 4 dòng nấm (ký hiệu N 1 , R 1 , R 4 , Sa 2 có nguồn gốc từ chanh núm, bưởi Năm roi và cam sành) được tuyển chọn dựa trên tỷ lệ đường kính vòng thủy phân casein (d) lớn hơn 10 mm và tỷ lệ giữa đường kính vòng thủy phân casein (d) và đường kính vòng phát triển của nấm mốc (D) đều từ 0,62-0,65.
- Sự kết hợp của 2 dòng Sa 2 và R 4 với tỷ lệ 1:3 cho kết quả sinh tổng hợp protease tốt nhất, hoạt tính protease sau 2 ngày lên men lỏng trong môi trường Czapeck Dox có bổ sung 1% casein làm cơ chất cảm ứng là 1,26±0,16 U/mL.
- Aspergillus niger là dòng nấm sợi phân bố rất rộng rãi trên nhiều loại cơ chất tự nhiên và trong các sản phẩm nông nghiệp (Pansear et al.
- Việc tuyển chọn được dòng nấm mốc phù hợp với điều kiện môi trường ở Việt Nam, giúp thúc đẩy sự tổng hợp enzyme mong muốn đóng vai trò rất quan trọng, là cơ sở bước đầu cho việc xác định tính chất và nghiên cứu khả năng ứng dụng của protease vào thực tế.
- Chính vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu là tuyển chọn dòng nấm mốc bản địa phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease đạt hiệu quả..
- Tổng cộng 27 dòng nấm mốc màu đen đã được phân lập từ vỏ các loại quả citrus, táo và sung, đã xác định tính chất (Trần Thanh Trúc, 2013), được trữ mẫu tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ.
- Các dòng nấm này đều đã được thử nghiệm sơ bộ cho thấy có khả năng sinh trưởng tốt và có khả năng sinh protease..
- Ký hiệu của các dòng nấm mốc theo nguồn phân lập từ cam sành (2 dòng: Sa 2 , Sa 3.
- niger đặc hiệu đối với protease: Khả năng sinh protease được đánh giá dựa trên sự thủy phân casein thông qua đường kính của vòng thủy phân casein dựa vào chất chỉ thị màu Coomassie Brilliant Blue R-250 (Shivakumar, 2012)..
- 2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sơ bộ dòng nấm mốc đặc hiệu cho quá trình sinh tổng hợp protease Thí nghiệm được thực hiện với mục tiêu phân nhóm và tuyển chọn các dòng nấm mốc có khả năng tạo ra protease dựa trên việc đo đường kính vòng thủy phân casein trên môi trường casein - agar.
- Các dòng nấm mốc khảo sát được nuôi cấy trên đĩa petri với môi trường PDA, sau 2-3 ngày, ở nhiệt độ 30 ± 2°C.
- Sau đó, các dòng nấm này được pha thành dung dịch huyền phù bào tử nấm với mật số 10 5 cfu/mL (Shivakumar, 2012).
- Đo đường kính vòng thủy phân casein (d, mm) và đường kính vòng phát triển của nấm mốc (D, mm)..
- Việc chọn lựa các dòng nấm mốc có khả năng tổng hợp protease cao dựa vào đường kính vòng thủy phân casein..
- 2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng kết hợp của các dòng nấm mốc đặc hiệu có khả năng sinh tổng hợp protease cao.
- Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu lựa chọn phương án kết hợp các dòng nấm mốc đặc hiệu để hoạt tính protease thu được là cao nhất từ các dòng nấm mốc được tuyển chọn mang khả năng sinh protease cao ở thí nghiệm 1 (dự kiến 4 dòng nấm, ký hiệu 1, 2, 3 và 4, kết hợp cặp đôi theo tỷ lệ huyền phù bào tử 1:1)..
- Các dòng nấm mốc có khả năng sinh protease cao trong thí nghiệm 1 được chọn và huyền phù được pha loãng đến mật số 10 5 cfu/mL.
- Riêng các nghiệm thức kết hợp của hai dòng nấm mốc, tỷ lệ.
- phối trộn của hai dòng nấm mốc là 1:1 và được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
- Huyền phù bào tử nấm của 4 dòng riêng lẻ và 6 nghiệm thức kết hợp sẽ được chủng vào môi trường casein – agar..
- Hai dòng nấm mốc kết hợp thích hợp có khả năng tạo ra protease nhiều nhất dựa theo đường kính vòng thủy phân casein d (mm) và tỷ lệ d/D (đường kính vòng thủy phân casein/ đường kính vòng phát triển của nấm mốc)..
- 2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ kết hợp hai dòng nấm mốc đặc hiệu đến khả năng sinh tổng hợp protease.
- Mục tiêu của thí nghiệm này là đánh giá tác động của việc kết hợp 2 dòng nấm mốc đặc hiệu (được lựa chọn ở thí nghiệm 2) với các tỷ lệ khác nhau đến khả năng sinh protease vào môi trường..
- Nghiên cứu được thực hiện giống như ở thí nghiệm 2 với 2 dòng nấm kết hợp có tính đặc hiệu với protease đã được lựa chọn từ thí nghiệm 2.
- Tuy nhiên, huyền phù bào tử nấm mốc của 2 dòng ở cùng mật số 10 5 cfu/mL được phối trộn theo các tỷ lệ kết hợp khác nhau, thay đổi từ .
- Bên cạnh đó, 7 tỷ lệ huyền phù bào tử của 2 dòng nấm mốc đã được chọn lựa cũng được lên men lỏng để xác định hiệu quả sinh tổng hợp protease.
- Chủng vào 1 mL hỗn hợp huyền phù bào tử nấm (10 5 cfu/mL) ở các tỷ lệ kết hợp khác nhau theo khảo sát và ủ ở nhiệt độ 30 ± 2°C trong 48 giờ (Coral et al.
- Tỷ lệ kết hợp của 2 dòng nấm mốc được chọn lựa dựa trên đường kính vòng thủy phân casein d (mm), tỷ lệ d/D và hoạt tính protease thu được tương ứng từ quá trình lên men lỏng..
- 2.3.4 Nhận diện dòng nấm mốc đã tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
- 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá khả năng sinh tổng hợp protease từ các dòng nấm mốc bản địa.
- Vòng thủy phân casein có mối quan hệ với lượng protease tiết ra bởi nấm mốc (Vermelho et al., 1996).
- Dựa vào kết quả thí nghiệm, các dòng nấm mốc được phân thành các nhóm riêng biệt theo tỷ lệ giữa đường kính vòng thủy phân casein (d) và đường kính vòng phát triển của nấm mốc (D) và dao động từ 0,39 đến 0,65.
- Hình ảnh minh họa hiệu quả thủy phân casein của 2 dòng A.
- niger điển hình R 4 và Re 4 (Hình 1) cho thấy, đường kính vòng thủy phân casein của dòng Re 4 khá nhỏ khi so.
- Ở tỷ lệ d/D <0,5 thể hiện khả năng thủy phân casein thấp gồm 4 dòng: Re 1 , Ga 4 , Nga, Re 3.
- có đường kính vòng thủy phân thấp (5,027,80mm) mặc dù đường kính vòng phát triển của nấm mốc tương đối lớn .
- Ở tỷ lệ (0,5  d/D <0,6) gồm 18 dòng (S 3 , S 6 , S 4 , S 5 , So 2 , T 4 , X 3 , G 2 , Ga 2 , G 4 , Sa 3 , T 3 , H 4 , Re 4 , T 2 , Re 2 , Ga 3 , Ga 1 ) với khả năng thủy phân casein và phát triển ở mức tương đối.
- Các dòng này có khả năng sinh tổng hợp protease nhưng không phải là dòng đặc hiệu..
- Các dòng còn lại có tỷ lệ d/D>.
- 0,6 (bảng 1) với vòng thủy phân và phát triển lớn gồm 7 dòng:.
- Bảng 1: So sánh hiệu quả thủy phân casein của các dòng A.
- niger Đường kính vòng thủy.
- phân casein (d, mm) Đường kính phát triển.
- của nấm mốc (D, mm) Tỷ lệ d/D.
- Đặc biệt dòng Sa 2 có nguồn phân lập từ vỏ quả cam sành có tỷ lệ d/D cao nhất (0,65) trong các dòng khảo sát với đường kính vòng thủy phân casein 10,63 mm và đường kính phát triển của nấm mốc là 16,38 mm.
- vòng thủy phân casein không cao lần lượt là 8,96 mm và 8,42 mm nhưng tỷ lệ với sự phát triển của nấm mốc nên tỷ số d/D lớn.
- Các dòng Sa 2 , R 4 , R 1 , N 1 , V có tỷ lệ d/D cao (d/D ≥ 0,62) nhưng có sự khác biệt về đường kính vòng thủy phân casein..
- Các dòng Sa 2 , R 4 , N 1 , R 1 có đường kính vòng thủy.
- phân casein (d) lớn dao động từ 10,12 đến 10,63 mm nhưng ngược lại giá trị d của dòng V lại thấp (8,96 mm)..
- Kết quả đo đạc cũng cho thấy, hầu hết các dòng nấm mốc có nguồn gốc từ táo Gala, Táo Red Delicious và gừng đều cho hoạt tính protease không cao (thể hiện ở giá trị tỷ lệ d/D nhỏ), trong khi đó không có dòng nấm được phân lập từ chanh giấy, bưởi da xanh, hạnh, cam xoàn có tỷ lệ d/D ≥ 0,6.
- Đồng thời, với cùng một nguồn phân lập, không phải tất cả các dòng nấm mốc cùng loài đều có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nhất định giống nhau (Sharma and De, 2011).
- Nhiều nghiên cứu tuyển chọn dòng vi sinh vật đặc hiệu đối với protease dựa trên đường kính vòng thủy phân protein đặc hiệu trên môi trường casein – agar hay gelatin – agar (Radha et al., 2012.
- Nghiên cứu cũng đề xuất các dòng Aspergillus có đường kính vòng thủy phân casein lớn hơn 10 mm vào nhóm có khả năng sinh tổng hợp protease mạnh.
- Việc khảo sát sự tương tác của hai dòng nấm mốc cùng loại nhằm tăng cường hiệu quả hoạt động sinh enzyme là bước cơ bản, đầu tiên có thể được áp dụng (Zhong-Tao et al., 2009).
- Trên cơ sở này, tiến hành xác định khả năng kết hợp 4 dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease hiệu quả nhất (dòng Sa 2 , N 1 , R 4 , R 1.
- 3.2 Đánh giá khả năng kết hợp dòng nấm mốc đặc hiệu đến hiệu quả thu nhận protease.
- Khi quan sát sự phát triển của nấm mốc và sự thay đổi đường kính vòng thủy phân casein trên môi trường casein – agarose cho thấy, việc kết hợp hai dòng nấm mốc ở tỷ lệ 1 : 1 cho hiệu quả cải thiện hơn khi sự kết hợp giữa hai dòng có hoạt tính mạnh tương đồng nhau (Sa 2 +N 1 ) hay các sự kết hợp còn lại giữa một dòng yếu với một dòng mạnh..
- Bảng 2: Ảnh hưởng của dòng nấm mốc Aspergillus niger kết hợp đến hiệu quả thủy phân casein TT Dòng A.
- niger Đường kính vòng thủy phân.
- nấm mốc (D, mm) Tỷ lệ d/D.
- Hình ảnh minh họa hiệu quả thủy phân protein của 2 dòng A.
- niger là R 1 và R 4 kết hợp cho thấy, đường kính vòng thủy phân casein của R 1 +R 4.
- kích thích hoạt động, sinh tổng hợp enzyme từ nấm mốc này..
- Hình 2: Vòng thủy phân casein của 2 dòng A.
- Tuy nhiên, trường hợp kết hợp hai dòng có khả năng tổng hợp protease với hoạt tính cao hơn (Sa 2.
- Bên cạnh đó, sự kết hợp của hai dòng Sa 2 và R 4 cho hiệu quả thu nhận protease cao vượt trội và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê khi so sánh với các nghiệm thức còn lại.
- Tỷ lệ d/D của sự kết hợp này cũng mang.
- Trong khi đó, sự kết hợp giữa dòng mạnh nhất (3,385±26 U/g) với một dòng yếu hơn (1,030±19 U/g) lại cho kết quả tốt nhất (3,944±34 U/g).
- Dựa trên kết quả khảo sát, hai dòng nấm mốc R 4 và Sa 2 được lựa chọn để nghiên cứu tỷ lệ kết hợp của hai dòng này trong quá trình sinh tổng hợp protease..
- 3.3 Đánh giá khả năng kết hợp hai dòng Sa 2.
- và R 4 đặc hiệu theo tỷ lệ khác nhau đến hiệu quả sinh tổng hợp protease.
- Cặp nấm mốc Sa 2 và R 4 được kết hợp với các tỷ lệ khác nhau nhằm tìm ra tỷ lệ kết hợp tốt nhất cho sự sinh tổng hợp protase và kết quả được tổng hợp ở Bảng 3..
- Bảng 3: Ảnh hưởng của tỷ lệ kết hợp hai dòng Sa 2 và R 4 đến hiệu quả sinh tổng hợp protease hoạt tính cao TT Tỷ lệ kết hợp.
- Đường kính vòng thủy phân casein (d, mm).
- Đường kính vòng phát triển nấm mốc.
- Từ kết quả thống kê đường kính vòng thủy phân casein (d) trên môi trường thạch casein thấy rằng sự thay đổi tỷ lệ kết hợp của hai dòng nấm mốc có sự khác biệt lớn đến hiệu quả sinh tổng hợp protease.
- Ở các tỷ lệ kết hợp của Sa 2 và R 4 là 3:1, 4:1 đường kính vòng thủy phân casein không được cải thiện.
- Khả năng sinh tổng hợp protease ở các tỷ lệ kết hợp này thấp mm) và tỷ số d/D nhỏ.
- Bên cạnh đó, tỷ lệ kết hợp của dòng Sa 2 và R 4.
- là 1:1 và 1:2 cho hiệu quả cải thiện hoạt tính protease khá cao với giá trị tỷ lệ d/D là 0,72-0,73..
- Ở tỷ lệ sử dụng 1:3 hay 2:1 của hai dòng nấm mốc này, đường kính thủy phân casein (d) lần lượt là 13,13 và 12,63 mm và tỷ lệ d: D tương ứng là 0,76 và 0,74.
- Xét về hoạt tính protease thu được ở 7 tỷ lệ kết hợp khác nhau, kết quả khảo sát cũng cho thấy, hoạt tính protease thu được có giá trị khá thấp khi lên men riêng lẻ một dòng nấm mốc Sa 2 hay.
- R 4 , trong khi đó, việc sử dụng kết hợp 2 dòng Sa 2.
- và R 4 ở tỷ lệ 1: 3 cho hoạt tính protease cao khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh với các tỷ lệ còn lại.
- Sự kết hợp của 2 dòng này ở tỷ lệ 2: 1 hầu như không tạo ra sự khác biệt về hoạt tính protease khi so sánh với các tỷ lệ 1: 1 hay 1:2.
- (2006) cũng tìm ra tỷ lệ 1:4 của sự kết hợp hai dòng A.
- niger sinh tổng hợp protease mạnh và yếu cũng như tỷ lệ 1:1 của hai dòng A..
- niger đồng khả năng là điều kiện kết hợp thích hợp cho sự cải thiện đáng kể sự sinh tổng hợp đồng thời hemicellulase, pectinase, cellulase, glucoamylase và protease..
- Từ các kết quả thu nhận cho thấy, việc nghiên cứu tuyển chọn và kết hợp hai dòng A.
- Dựa trên kết quả khảo sát, mức tỷ lệ kết hợp của hai dòng A.
- Hai dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp.
- Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của 2 dòng nấm mốc R 4 và Sa 2 có băng tương ứng ở vị trí 260 bp so với thang chuẩn (Hình 3)..
- Hình 4: Tỷ lệ tương đồng về gene của dòng nấm Sa 2 và dòng A.
- Hình 5: Tỷ lệ tương đồng về gene của dòng nấm R 4 và dòng A.
- Sử dụng phần mềm Blast N, so sánh với trình tự DNA của các dòng nấm mốc có trong ngân hàng dữ liệu NCBI cho thấy, dòng Sa2 có tỷ lệ đồng.
- niger US11 là 100% (Hình 4), dòng R4 có tỷ lệ đồng hình với A.
- Từ 27 dòng nấm mốc bản địa, sau quá trình tuyển chọn từng dòng riêng lẻ bằng phương pháp đo vòng thủy phân casein trên môi trường casein – agar và kết hợp theo kiểu tương tác cặp đã tìm ra 2 dòng Aspergillus niger Sa 2 và R 4 với tỷ lệ phối trộn của huyền phù bào tử nấm (mật số 10 5 cfu/mL) theo thứ tự kết hợp giữa hai dòng là 1:3 (v/v) cho hiệu quả thu nhận protease tốt nhất