- TUYỂN CHỌN NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH ĐƯỜNG HÓA CAO TỪ MEN RƯỢU XUÂN THẠNH. - Nhằm góp phần nâng cao năng suất cũng như chất lượng rượu Xuân Thạnh, thực hiện đề tài này nhằm tuyển chọn được những dòng nấm mốc có hoạt tính đường hóa cao trong các viên men rượu Xuân Thạnh đã được Viện NC&PT CNSH thu thập. - 5,8 – 8,3 và 3,6 – 6,4 Log cfu/g trọng lượng khô của viên men, bên cạnh đó cũng đã phân lập được 43 dòng nấm mốc từ các viên men trên. - Sau đó, 43 dòng nấm mốc này được khảo sát khả năng phân giải tinh bột và đã chọn được 9 dòng có khả năng phân giải tinh bột cao nhất với độ tin cậy 95%.. - Tuyển chọn được 3 dòng nấm mốc có khả năng đường hóa cao nhất với hàm lượng glucose đạt đến 36 – 37% (w/v) ở độ tin cậy 95%. - Các dòng nấm mốc tuyển chọn được định danh sơ bộ thuộc giống Rhizopus thuộc giống Zygomycetes và Mucorales.. - Trong đó nấm mốc là hệ vi sinh vật rất quan trọng, là một trong các hệ vi sinh vật có khả năng sản xuất ra các enzime phân giải tinh bột, đặc biệt là -amylase và amyloglucosidase (Ray, 2001a, 2001b. - Do đó, nấm mốc là tác nhân mở đầu cho quá trình lên men bằng khả năng phân giải tinh bột và khả năng đường hóa. - Cùng với nấm men, nấm mốc trong viên men cũng có vai trò quyết định giúp kiểm soát được quá trình lên men và dự đoán được sản phẩm.. - Nội dung của đề tài này là chọn lọc những giống nấm mốc có hoạt tính đường hoá cao từ viên men rượu Xuân Thạnh nhằm góp một phần vào việc nâng cao chất lượng viên men làm rượu.. - Xác định được mật số hệ vi sinh vật hiện diện và phân lập được những dòng nấm mốc thuần từ các viên men rượu.. - Khảo sát và chọn ra những dòng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột cao.. - Từ kết quả trên tiếp tục tuyển chọn những dòng nấm mốc có khả năng đường hóa mạnh nhất.. - Nhận dạng, định danh các dòng nấm mốc đã được tuyển chọn ở mức độ giống.. - 2.1 Xác định mật số vi sinh vật và phân lập nấm mốc trong các viên men rượu Xác định được mật số vi sinh vật gồm nấm mốc, nấm men và vi khuẩn lactic và phân lập được các dòng nấm mốc thuần. - Men khô được khảo sát phân tích mật số vi sinh vật ngay sau khi thu thập bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa Petri, sau đó tiếp tục phân lập các nấm mốc từ các đĩa Petri đã được xác định mật số vi sinh vật.. - Đếm số khuẩn lạc nấm mốc và nấm men và vi khuẩn lactic. - Từ các đĩa thạch có các khuẩn lạc nấm mốc phát triển tốt, riêng rẽ, chọn các khuẩn lạc có đặc điểm khác nhau như màu sắc, đường kính, độ dày của hệ khuẩn ty.. - 2.2 Phương pháp khảo sát khả năng phân giải tinh bột. - Với mục đích tuyển chọn được những dòng nấm mốc có hoạt tính enzime cao, tất cả 43 dòng nấm mốc thuần được khảo sát khả năng phân giải tinh bột trong môi trường tinh bột nếp-agar. - Môi trường chứa 0,5% tinh bột nếp, 0,1% pepton (Oxoid, L34) và 1,5% agar (Oxoid, L13). - Cấy mốc bằng cách dùng kim cấy cắt một mẫu nấm mốc đặt vào giữa đĩa môi trường tinh bột agar và ủ ở 30 o C trong 48 giờ. - Xác định sự phân giải tinh bột bằng cách nhỏ vào đĩa môi trường dung dịch Iod 0,25%.. - 2.3 Tuyển chọn nấm mốc có hoạt tính đường hóa cao. - 2.4 Nhận dạng và định danh các nấm mốc đã được tuyển chọn. - Các nấm mốc tuyển chọn có hoạt tính enzime cao được nhận dạng dựa trên các đặc tính hình thái và sinh trưởng. - 3.1 Xác định mật số vi sinh vật và phân lập nấm mốc trong các viên men rượu 3.1.1 Mật số vi sinh vật trong các viên men. - Nấm mốc Nấm men Vi khuẩn lactic. - Kết quả thí nghiệm cho thấy mật số nấm mốc, nấm men trong các viên men nằm trong khoảng 6,3 – 8,5 log cfu/g trọng lượng khô, trong khi đó mật số vi khuẩn lactic khoảng 3,6 – 6,4 log cfu/g thấp hơn so với nấm mốc và nấm men. - Kết quả này cũng tương đối phù hợp với kết quả nghiên cứu của Dung et al., 2005 và cho thấy được sự chiếm ưu thế của nấm mốc và nấm men trong viên men rượu so với vi khuẩn lactic. - Qua đó có thể kết luận sơ bộ rằng nấm mốc và nấm men trong hầu hết 14 viên men rượu Xuân Thạnh trên có khả năng ức chế được sự phát triển của vi khuẩn bất lợi, giúp cho quá trình lên men chủ động hơn.. - Mặc dù mật số nấm mốc thường thể hiện cho khả năng nảy mầm của nấm mốc hơn là cho sinh khối của nấm mốc nhưng trong trường hợp này, việc sử dụng số liệu log cfu/g trọng lượng khô là hoàn toàn phù hợp vì khả năng nảy mầm là biểu hiện thiết yếu cho khả năng lên men của nấm mốc.. - 3.1.2 Các dòng nấm mốc phân lập được từ các viên men rượu. - Bốn mươi ba dòng nấm mốc phân lập từ 14 viên men rượu Xuân Thạnh. - Số lượng các dòng nấm mốc phân lập được từ các viên men có thể giống hoặc khác nhau.. - Bên cạnh đó, tuy các dòng nấm mốc được phân lập từ cùng một viên men có hình thái và cấu tạo khác nhau nhưng có một số dòng nấm mốc của những viên men khác nhau thì lại có hình thái và cấu tạo giống nhau. - Tuy nhiên, chưa thể khẳng định các dòng nấm mốc đó giống hay khác nhau mà phải tiến hành các thí nghiệm tiếp theo để khảo sát hoạt tính của 43 dòng nấm mốc này.. - 3.2 Thử khả năng phân giải tinh bột của nấm mốc. - Bảng 2: Kết quả khảo sát khả năng phân giải tinh bột của nấm mốc STT Viên. - Đường kính vùng phân giải tinh bột (mm) 1. - A 2 B C Trung bình. - 6 3 3.1 trung bình efghi. - 7 3 3.2 trung bình efghi. - 8 3 3.3 trung bình hijklm. - 9 3 3.4 trung bình ijklm. - 10 3 3.5 trung bình jklm. - 11 4 4.1 trung bình bcde. - 12 4 4.2 trung bình ijklm. - 13 4 4.3 trung bình hijklm. - 14 4 4.4 trung bình defgh. - 15 4 4.5 trung bình hijklm. - 17 5 5.1 trung bình bcd. - 18 5 5.2 trung bình m. - 19 5 5.3 trung bình bcd. - 20 6 6.1 trung bình fghij. - 23 7 7.2 trung bình cdef. - 24 8 8.1 trung bình ghijklm. - 27 9 9.2 trung bình fghij. - 29 9 9.4 trung bình jklm. - 32 10 10.3 trung bình bc. - 41 14 14.1 trung bình ghijk. - 42 14 14.2 trung bình bcd. - 1 Các giá trị trung bình của đường kính phân giải tinh bột có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%.. - Để tuyển chọn các dòng nấm mốc có hoạt tính enzime -amylase cao, tất cả 43 dòng nấm mốc đã phân lập từ 14 viên men được khảo sát khả năng phân giải tinh bột trên môi trường tinh bột nếp. - Nấm mốc được chuyển vào môi trường tinh bột nếp bằng cách dùng kim cấy cắt một mẫu nấm mốc đặt vào giữa đĩa môi trường và ủ ở 30 o C trong 48 giờ. - Xác định sự phân giải tinh bột bằng cách nhỏ vào đĩa môi trường dung dịch Iod 0,25% và đo đường kính của vùng không màu (vì nếu còn tinh bột thì khi nhỏ dung dịch Iodine vào sẽ tạo màu xanh điển hình).. - Bảng 2 thể hiện kết quả khả năng sinh trưởng của nấm mốc (sự hiện diện của hệ khuẩn ty) và đường kính vùng phân giải tinh bột (tính bằng mm) trên môi trường tinh bột nếp sau khi ủ 2 ngày ở 30 o C.. - Đa số các dòng nấm mốc đều phát triển tốt trên môi trường tinh bột nếp nhưng không có nghĩa là chúng đều có khả năng phân giải tinh bột tốt. - Bên cạnh hầu hết các dòng nấm mốc đều phân giải tinh bột theo kiểu hệ khuẩn ty phát triển đến đâu sẽ phân giải hết tinh bột đến đó thì còn có một số dòng cá biệt như 4.6 và 11.2 tuy hệ khuẩn ty sinh trưởng và phát triển rất tốt nhưng khả năng phân giải tinh bột lại rất kém: vùng phân giải tinh bột chỉ tập trung quanh điểm cấy mốc hoặc chỉ phân giải một lớp mỏng trên bề mặt.. - Kết quả xử lý thống kê cho thấy khả năng phân giải tinh bột (được xác định dựa trên đường kính vùng phân giải tinh bột) của 43 dòng nấm mốc có sự khác biệt ý nghĩa (p <. - Trong đó, 9 dòng nấm mốc và 14.3 có khả năng phân giải tinh bột cao nhất có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%. - Vì vậy, 9 dòng nấm mốc này được chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo là khảo sát khả năng đường hóa của chúng.. - 3.3 Thử khả năng đường hóa của nấm mốc. - Chín dòng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột cao nhất chọn từ thí nghiệm 2 tiếp tục được khảo sát về khả năng đường hóa. - Kết quả về khả năng đường hóa của 9 dòng nấm mốc được trình bày trong Bảng 3.. - Bảng 3: Kết quả khảo sát khả năng đường hóa của nấm mốc STT Dòng. - Hàm lượng đường khử. - Hàm lượng Glucose. - Ở các dòng nấm mốc trên không thấy được sự phát triển nhiều của hệ khuẩn ty, riêng hai dòng mốc 2.1 và 10.1 thì hệ khuẩn ty phát triển dày đặc trong các bình tam giác và lượng dịch rỉ sau 3 ngày rất ít.. - Qua đó ta có thể nhận thấy trong 9 dòng nấm mốc trên có hai đặc tính khác nhau: một dạng là theo hướng sinh ra enzime (các dòng và 14.3), một dạng là theo hướng phát triển sinh khối (các dòng 2.1 và 10.1).. - Ở hai dòng nấm mốc 2.1 và 10.1 hạt nếp hầu như còn nguyên, dịch rỉ rất ít và giống như nước cháo đặc. - Trái lại, ở ba dòng nấm mốc và 14.3 dịch rỉ rất nhiều và trong suốt, sau khi ly tâm phần xác nếp còn lại rất xốp và rời rạc với nhau. - Các dòng nấm mốc còn lại dịch rỉ hơi đục, sau khi thủy phân thì phần xác nếp còn hơi nhão nên dính vào nhau.. - Điều này chứng tỏ lượng đường khử do nấm mốc tạo ra chủ yếu là glucose. - Ba nhóm nấm mốc được sắp xếp theo hàm lượng đường khử và glucose từ cao đến thấp như sau: nhóm 1 bao gồm các dòng và 14.3;. - Kết quả thống kê cho thấy có sự khác biệt giữa ba nhóm nấm mốc trên có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%.. - Các dòng mốc có khả năng tạo được lượng dịch rỉ nhiều thì đồng thời hàm lượng glucose sinh ra sẽ cao và ngược lại. - Tuy nhiên ở hai dòng nấm mốc 2.1 và 10.1 tuy có o Brix tương đối gần bằng các dòng nấm mốc còn lại nhưng hàm lượng đường khử và hàm lượng glucose lại rất thấp. - o Brix cũng chỉ là một thông số ban đầu để đánh giá sơ bộ khả năng đường hóa của nấm mốc, tuy nhiên để tuyển chọn được những dòng nấm mốc có hoạt tính đường. - Tóm lại, qua thí nghiệm khảo sát khả năng đường hóa của nấm mốc đã tuyển chọn được 3 dòng nấm mốc có hoạt tính đường hóa cao nhất (có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%) là và 14.3 thể hiện ở kết quả thống kê của hàm lượng glucose được sinh ra. - Ba dòng nấm mốc này sẽ được tiến hành định danh sơ bộ ở mức độ giống.. - 3.4 Nhận dạng, định danh các nấm mốc đã được tuyển chọn ở mức độ giống Ba dòng nấm mốc có khả năng đường hóa cao nhất được tuyển chọn qua thí nghiệm 3 là và 14.3 được nuôi cấy trên môi trường Khoai tây 20%, Glucose 2%, Agar 2%, (NH 4 ) 2 SO 4 0,2%, MgSO 4 0,05%, CaSO 4 0,02%, KH 2 PO 4. - Qua kết quả quan sát thì 3 dòng nấm mốc trên có chung một số đặc tính như sau:. - Từ các đặc tính trên, định danh sơ bộ cả 3 dòng nấm mốc và 14.3 đều thuộc giống Rhizopus. - Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của Nguyễn Đức Lượng (1998) cho thấy Rhizopus là một trong những giống nấm mốc chiếm ưu thế trong các viên men rượu.. - Hình 2: Một số đặc điểm chung của 3 dòng nấm mốc được tuyển chọn. - đã phân lập được 43 dòng nấm mốc thuần chủng.. - Qua thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải tinh bột của các dòng nấm mốc thuần đã chọn được 9 dòng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột cao nhất có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% gồm có các dòng và 14.3.. - Từ 9 dòng nấm mốc trên, khảo sát khả năng đường hóa và đã tuyển chọn được 3 dòng và 14.3 có hoạt tính đường hóa cao nhất với hàm lượng glucose cao nhất đạt đến 37% (w/v) dịch rỉ có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%. - Qua kết quả định danh sơ bộ đã xác định 3 dòng nấm mốc trên thuộc giống Rhizopus.