TUYỂN CHỌN VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM (CÓ KHẢ NĂNG HÒA TAN LÂN VÀ KALI) PHÂN LẬP TỪ VẬT LIỆU PHONG HÓA CỦA VÙNG NÚI ĐÁ HOA CƯƠNG TẠI NÚI CẤM, TỈNH AN GIANG

- TUYỂN CHỌN VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM (CÓ KHẢ NĂNG HÒA TAN LÂN VÀ KALI) PHÂN LẬP.
- Hai mươi tám dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường Aleksandrov từ hai mươi mẫu vật liệu phong hóa của đá hoa cương đều có khả năng tổng hợp ammonium trong môi trường Burk ‘s.
- Giải trình tự 3/5 dòng vi khuẩn đã tuyển chọn và sử dụng phần mềm BLAST N để so sánh với trình tự các dòng vi khuẩn có trong GenBank của NCBI.
- Kết quả cho thấy, dòng vi khuẩn CA10 có tỉ lệ đồng hình cao với dòng AY117623.1 Rhizobium tropici PRF34 tỉ lệ 99%, dòng CA18 có tỉ lệ đồng hình cao với dòng JF496331.1 Bacillus subtilis A2-9 với tỉ lệ 99%, dòng CA29 có tỉ lệ đồng hình cao với dòng JN896359.1 Rhizobium multihospitium CC-13H với tỉ lệ 99%..
- Đánh giá khả năng cố định đạm của hỗn hợp ba dòng vi khuẩn này trên Hành lá (Allium fistulosum sp.) và Mồng tơi (Basella alba L.) cho thấy các dòng vi khuẩn này giúp cây phát triển chiều cao, trọng lượng và năng suất..
- Từ khóa: Cố định đạm, hàm lượng nitrate, kỹ thuật PCR, vật liệu phong hóa, vi khuẩn hòa tan lân và kali.
- Nguyễn Thị Thu Hà (2009), phân lập được 71 dòng vi khuẩn từ các loài cỏ chăn nuôi tại các tỉnh Vĩnh Long.
- Mục tiêu của đề tài là tuyển chọn và định danh được những dòng vi khuẩn có hoạt tính cố định đạm, hòa tan lân và kali mạnh nhất nhằm ứng dụng vào lĩnh vực sản xuất phân vi sinh (một dòng vi khuẩn có cả 3 đặc tính tốt)..
- Đồng thời đánh giá được hiệu quả những dòng vi khuẩn đã tuyển chọn bằng việc thử nghiệm trên rau hành lá (Allium fistulosum sp.) và mồng tơi (Basella alba L.)..
- 2.1.1 Xác định khả năng phát triển của vi khuẩn bằng môi trường không đạm Từ những dòng vi khuẩn được Nguyễn Ngọc Giàu phân lập (2011) (đã có mang khả năng hòa tan lân và kali) tiến hành nuôi cấy trên môi trường Burk’s (không nitơ) đặc và ủ ở 30 0 C, theo dõi sự phát triển của chúng từ 1-2 ngày..
- 2.1.2 Xác định hàm lượng NH 4 + do vi khuẩn tạo ra bằng phương pháp so màu (thuốc thử phenol - nitroprusside).
- Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn được thể hiện qua mức hấp thụ quang phổ của các mẫu đo.
- 2.2 Nhận diện các dòng vi khuẩn.
- 2.2.1 Tách chiếc DNA của vi khuẩn theo phương pháp của Neumann, et al.
- (1992) Nuôi vi khuẩn trong 5 ml dung dịch LB lỏng, lắc trên máy lắc trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng để thu sinh khối, thực hiện các bước trích DNA như sau:.
- Chuyển 4 ml dịch vi khuẩn nuôi trong LB sang 2 tuýp Eppendorf 2ml → Ly tâm tuýp Eppendorf với tốc độ 13.000 vòng trong 5 phút → Loại bỏ phần nước → Hút 250 µl dung dịch TE cho vào tuýp trên và đánh tan sinh khối, dồn mẫu ở 2 tuýp vào 1 tuýp eppendorf 2 ml → Thêm vào 50 µl SDS 10% để hòa tan DNA → Thêm 5 µl proteinase K sau đó ủ ở nhiệt độ 65 0 C trong 20 phút, 5 phút đảo ngược tuýp một lần → Thêm vào 400 µl CTAB 10% 0,7M NaCl → Ủ ở nhiệt độ 65 0 C trong 20 phút → Thêm vào 600 µl Chloroform: isoamyl alcohol (24:1) để tủa protein và tạo màng ngăn giữa DNA và protein → Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng trong 10 phút → Chuyển phần dịch trong trên màng ngăn sang tuýp eppendorf 2 ml mới (thao tác nhẹ nhàng, cẩn thận tránh làm vỡ màng ngăn.
- DNA của các dòng vi khuẩn sau khi trích được tiến hành PCR với cặp mồi 8F và 1492R.
- Nhận diện các dòng vi khuẩn ở băng (band) 1500 bp theo thang chuẩn 100bp..
- 2.2.3 Giải trình tự một số dòng vi khuẩn.
- 2.3 Thí nghiệm đánh giá hiệu quả của vi khuẩn trên rau xanh 2.3.1 Đánh giá năng suất thu được.
- Tiến hành thí nghiệm với hai loại rau ăn lá là hành lá và mồng tơi nhằm đánh giá hiệu quả các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn.
- Các nghiệm thức sử dụng trong thí nghiệm như sau: Nghiệm thức 1 (đối chứng, không bón phân), Nghiệm thức 2 (sử dụng hỗn hợp các dòng vi khuẩn có hoạt tính cố định đạm, hòa tan lân và kali tốt với tỉ lệ 1lít/m 2.
- Nghiệm thức 4 (kết hợp bón phân N-P-K với hỗn hợp các dòng vi khuẩn có hoạt tính cố định đạm, hòa tan lân và kali tốt với tỉ lệ 1g/m 2 N-P-K + 750ml/m 2 dung dịch hỗn hợp các dòng vi khuẩn)..
- 3.1 Kết quả xác định khả năng tổng hợp amonium của các dòng vi khuẩn Từ những dòng vi khuẩn được Nguyễn Ngọc Giàu (2011) phân lập (đã có mang khả năng hòa tan lân và kali), tiến hành cấy lên môi trường Burk’s (không nitơ) đặc và ủ ở 30 0 C.
- Hình 1: Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường Burk’s sau 72 giờ cấy.
- Chuyển những dòng vi khuẩn trên vào môi trường Burk’s lỏng để đo sự hình thành amonium bằng phương pháp so màu (Phenol-Nitroprusside).
- Kết quả cho thấy cả 28 dòng vi khuẩn đều có khả năng cố định đạm (so với kết quả của mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn ở mức ý nghĩa 1.
- Khả năng tổng hợp NH 4 + có sự biến động theo thời gian, hầu hết các dòng vi khuẩn tổng hợp đạm đạt mức cao nhất ở ngày nuôi thứ 4 rồi giảm dần ở những ngày nuôi tiếp theo..
- Dòng vi khuẩn.
- Hình 2: Khả năng tổng hợp NH 4 + (mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 4 ngày chủng.
- Đa số các dòng vi khuẩn đều có khả năng có định đạm nhưng hiệu quả không cao (dưới 5mg/l).
- Tuy nhiên, một vài dòng vi khuẩn lại có khả năng cố định đạm rất tốt, cụ thể là các dòng CA03 (11,459mg/l), CA04 (9,816mg/l), CA10 (6,390mg/l), CA18 (10,973 mg/l), CA29 (15,398mg/l) đều có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 1% so với đối chứng (0,273mg/l) (Hình 2).
- Đây là 5 dòng vi khuẩn được chọn để kiểm.
- Hình 3: Khả năng tổng hợp nitrogenase của 5 dòng vi khuẩn (µmol).
- Kết quả trên cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn được chọn đều có khả năng tạo nitrogenase.
- Hàm lượng nitrogenase do các dòng vi khuẩn tạo ra dao động từ 8,818µmol đến 12,970µmol.
- Tiến hành chọn ra dòng vi khuẩn có cả 3 hoạt tính cố định đạm, hòa tan lân và kali tốt là CA10, CA18 và CA29 để nhận diện bằng kỹ thuật PCR..
- 3.2 Kết quả nhận diện các dòng vi khuẩn.
- Phổ điện di trên gel agarose cho thấy cả 3 dòng vi khuẩn đều có băng (band) ở vị trí 1500bp so với thang chuẩn (Hình 4)..
- Hình 4: Phổ điện di của sản phẩm PCR được nhân lên từ đoạn 16S rRNA của 3 dòng vi khuẩn.
- Tiến hành giải trình tự các dòng vi khuẩn, sử dụng chương trình BLAST N để so sánh mức độ đồng hình của trình tự các dòng vi khuẩn được tuyển chọn với trình tự của các dòng vi khuẩn trong ngân hàng gen trên trang wed:.
- Rhizobium tropici là một loài vi khuẩn mới lạ sống phổ biến trong đất, có khả năng tạo nốt sần trên cây đậu Cô Ve (một loại cây được trồng nhiều tại vùng núi An Giang) và các cây thuộc chi keo dậu (Leucaena) (http://ijs.sgmjournals.org/content/41/3/417.abstract)..
- Hình 5: Mức độ tương đồng của dòng CA10 so với các dòng khác trên cơ sở dữ liệu NCBI.
- Hình 6: Mức độ tương đồng của dòng CA18 so với các dòng khác trên cơ sở dữ liệu NCBI.
- Hình 7: Mức độ tương đồng của dòng CA29 so với các dòng khác trên cơ sở dữ liệu NCBI.
- Hình 8: Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ di truyền giữa 3 dòng vi khuẩn so với các dòng vi khuẩn khác trên CSDL NCBI (Maximum-Likehood tree).
- Theo phân tích mối quan hệ di truyền của 3 dòng vi khuẩn này (hình 8) cho thấy cây phả hệ chia ra 2 nhánh (cluster) lớn có khoảng cách tương đương nhau.
- Dòng CA10 và CA29 ở nhánh I có mối quan hệ rất gần gũi với các dòng vi khuẩn nốt rễ thuộc chi Rhizobium mà cụ thể là Rhizobium multihospitium và Rhizobium tropici..
- Đây là nhóm vi khuẩn cố định đạm, gram âm, có khả năng khoáng hóa đồng thời hòa tan lân hữu cơ và vô cơ thành lân hữu dụng (Khan, et al., 2009).
- Trong khi đó, dòng CA18 ở nhánh II có mối quan hệ gần gũi với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis.
- Đây là nhóm vi khuẩn hình que, gram dương, hiếu khí, có khả năng sản sinh acid hữu cơ hòa tan lân khó tan (Rodriguez và Fraga., 1999)..
- Đối chứng Vi khuẩn N-P-K 75% Vi khuẩn 25% N-P-K Nghiệm thức.
- Hình 9: Hiệu quả của hỗn hợp các dòng vi khuẩn được tuyển chọn và phân vô cơ (N-P-K) trên năng suất hành lá sau 2 đợt (g/m 2.
- Khi sử dụng hỗn hợp các dòng vi khuẩn năng suất trung bình tăng 1,29 lần so với đối chứng, việc sử dụng hoàn toàn phân hóa học năng suất trung bình tăng 1,69 lần so với đối chứng và khi kết hợp chủng vi khuẩn với 25% phân hóa học cho năng suất trung bình tăng 1,52 lần so với đối chứng.
- Năng suất thu được ở nghiệm thức 3 so với nghiệm thức 4 chênh lệch không nhiều chứng minh được rằng việc sử dụng hỗn hợp các dòng vi khuẩn có khả năng thay thế một lượng phân hóa học đáng kể.
- Tiến hành đo hàm lượng nitrate trong hành lá, kết quả kiểm tra cho thấy hành lá có hàm lượng nitrate thấp nhất khi sử dụng hỗn hợp các dòng vi khuẩn và cao nhất ở nghiệm thức bón phân hóa học (Bảng 1)..
- Bảng 1: Hiệu quả của hỗn hợp các dòng vi khuẩn được tuyển chọn và phân vô cơ (N-P-K) trên hàm lượng nitrate (mg/kg) của hành lá trong 2 đợt.
- Vi khuẩn .
- 75% Vi khuẩn : 25% N-P-K Kết quả phân tích đất trong bảng 2 cho thấy độ chênh lệch pH giữa các nghiệm thức không nhiều và pH đất khá ổn định ở mức trung tính.
- Hàm lượng đạm tổng, lân dễ tiêu, kali hòa tan và thành phần chất hữu cơ trong đất ở các nghiệm thức có sử dụng vi khuẩn đều tăng so với mẫu đất trước thí nghiệm.
- Điều này cho thấy các dòng vi khuẩn có hiệu quả tích cực đối với thành phần dinh dưỡng trong đất..
- Vi khuẩn N-P-K Vi khuẩn : 25% N-P-K .
- Trong đó, nghiệm thức sử dụng hỗn hợp các dòng vi khuẩn với 25% phân hóa học có sự chênh lệch không quá nhiều so với nghiệm thức sử dụng 100% phân hóa học.
- Vì vậy, việc sử dụng hỗn hợp các dòng vi khuẩn trên rõ ràng là có hiệu quả ở mức ý nghĩa 1% đối với trọng lượng và năng suất mồng tơi..
- Hình 10: Hiệu quả của hỗn hợp các dòng vi khuẩn được tuyển chọn và phân vô cơ (N-P-K) trên năng suất mồng tơi sau 2 đợt (g/m 2.
- Kết quả kiểm tra hàm lượng nitrate ở bảng 3 cho thấy, cây có hàm lượng nitrate thấp nhất khi sử dụng hỗn hợp các dòng vi khuẩn.
- Bảng 3: Hiệu quả của hỗn hợp các dòng vi khuẩn được tuyển chọn và phân vô cơ (N-P-K) trên hàm lượng nitrate (mg/kg) của mồng tơi trong 2 đợt.
- Vi khuẩn 5,87 38,50.
- 75% Vi khuẩn : 25% N-P-K Kết quả phân tích đất trồng mồng tơi (Bảng 4) cũng tương tự hành lá, pH đất sau thu hoạch tăng ít, độ chênh lệch pH giữa các nghiệm thức không nhiều cho thấy pH đất khá ổn định ở mức trung tính..
- 28 dòng vi khuẩn được phân lập từ vùng núi Cấm tỉnh An Giang đều có khả năng cố định đạm..
- Có 5/28 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH 4 + rất cao bao gồm: dòng CA03, CA04, CA10, CA18 và CA29..
- Tuyển chọn được 3/5 dòng vi khuẩn có hoạt tính tốt đó là CA10, CA18 và CA29..
- Kết quả đánh giá hiệu quả các dòng vi khuẩn trên rau hành lá (Allium fistulosum sp.) và mồng tơi (Basella alba L.) cho thấy các dòng vi khuẩn có khả năng làm tăng độ phì nhiêu cho đất, giúp tăng chiều cao cây cũng như trọng lượng và năng suất..
- Đối với canh tác trên diện tích rộng, cần nhân giống cấp 3 các dòng vi khuẩn để tiết kiệm chi phí..
- Tiếp tục thí nghiệm, khảo sát hiệu quả các dòng vi khuẩn trên các loại rau khác nhau trên diện tích rộng, điều kiện sinh thái khác nhau đồng thời cần bố trí thêm nhiều nghiệm thức để từ đó đề xuất công thức bón phân hợp lí cho từng đối tượng cụ thể..
- Khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn Azospirillium lipoferum.
- Phân lập và nhận diện vi khuẩn hòa tan lân và kali trong vật liệu phong hóa từ đá granite núi Cấm – An Giang.
- Phân lập và đặc tính các dòng vi khuẩn nội sinh trong một số cây cỏ chăn nuôi