Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA nội sinh trong cây cà phê vối (Coffea canephora Pierre ex A. froehner) trồng tại tỉnh Đắk Lắk

- TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN LÂN, TỔNG HỢP IAA NỘI SINH TRONG CÂY CÀ PHÊ VỐI (Coffea canephora PIERRE EX A.
- Cà phê vối, cố định đạm, hòa Keywords:.
- Cây cà phê vối là cây công nghiệp mang lại lợi ích to lớn cho đồng bào Tây Nguyên.
- Trong nghiên cứu này, 100 dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ rễ, lá và trái cây cà phê vối trồng tại huyện Ea H’leo và Krông Năng, tỉnh Đắk Lắk.
- Đa số các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng tròn, độ nổi lài hoặc mô, bìa nguyên, chủ yếu có màu trắng trong, trắng đục hoặc vàng và đều tạo thành vòng pellicle sau 72 giờ nuôi cấy trong môi trường LGIP, NFb và BAz bán đặc.
- Kích thước tế bào vi khuẩn dao động trong khoảng μm, đa số hình que, chuyển động và Gram âm.
- Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và sinh tổng hợp IAA cho thấy dòng L.R150-3 có khả năng tổng hợp ammonium cao nhất là 0,289 mg/L.
- dòng B.R157-2 có khả năng hòa tan lân khó tan đạt 4,3 mg P 2 O 5 /mL.
- dòng L.R150-1 có khả năng sinh tổng hợp IAA tốt đạt 19,206 μg/mL.
- Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA nội sinh trong cây cà phê vối (Coffea canephora Pierre ex A..
- Trong những năm gần đây, rất nhiều nghiên cứu về các vi khuẩn có ích đã được thực hiện, những vi khuẩn này có thể nội sinh hay ngoại sinh có khả năng cố định đạm tự do hoặc hòa tan các phosphate khó tan làm tăng năng suất cây trồng, đồng thời khắc phục được một số hạn chế khi sử dụng phân bón hóa học, đặc biệt là nhóm vi khuẩn nội sinh của cây trồng.
- Nhóm vi sinh vật này gọi là PGPB (plant growth promoting bacteria) và có những dòng thể hiện ưu điểm mạnh như Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Burkholderia, Pseudomonas, Rhizobium và Gluconacetobacter,… Ngoài khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan, các nhóm vi khuẩn này còn có khả năng tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA (indole-3-acetic acid), IBA (indole-3-butyric acid), GA (gibberelin.
- Nhiều nghiên cứu về PGPB trên cây cà phê đã được tiến hành từ lâu ở một số nơi trên thế giới như Mexico (Jimenez-Salgado et al., 1997).
- Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây lúa (Cao Ngọc Điệp và ctv., 2007), cây bắp (Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Mai Khanh, 2010).
- Tuy nhiên, nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong cây cà phê vối vẫn chưa được tiến hành.
- Vì vậy, việc phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA tốt nội sinh trong cây cà phê vối (Coffea canephora Pierre ex A.
- Mẫu vật gồm lá, rễ, trái cây cà phê vối trồng tại huyện Ea H’leo và Krông Năng (Đắk Lắk).
- sạch khuẩn sau đó mang về tiến hành xử lý mẫu và phân lập tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ..
- 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập vi khuẩn.
- Môi trường được ủ 2 - 3 ngày đến khi thấy vòng sáng (pellicle) xuất hiện là dấu hiệu sự phát triển của vi khuẩn nội sinh thì cấy chuyển nhiều lần để tách ròng vi khuẩn.
- Quan sát hình dạng, khả năng chuyển động và tiến hành nhuộm Gram các dòng vi khuẩn đã phân lập (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)..
- 2.2.2 Khảo sát khả năng tổng hợp ammonium, tổng hợp IAA, hòa tan lân khó tan của những dòng vi khuẩn phân lập được.
- Các dòng vi khuẩn ròng được khảo sát khả năng tổng hợp ammonium trong môi trường LGIP, NFb và BAz lỏng bằng phương pháp so màu indophenol blue ở bước sóng 636 nm (OD 636 nm.
- khảo sát khả năng tổng hợp IAA trong môi trường LGIP, NFb và BAz lỏng có bổ sung tryptophan (100 mg/L) bằng phương pháp so màu salkowsky ở bước sóng 530 nm (OD 530 nm.
- khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan bằng phương pháp định tính sử dụng môi trường nuôi vi khuẩn NBRIP (Nautiyal, 1999).
- xác định hiệu quả hòa tan lân E.
- định lượng lân hòa tan bằng phương pháp so màu molybdenum blue ở bước sóng 880 nm (OD 880 nm.
- 2.2.3 Nhận diện các dòng vi khuẩn triển vọng bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
- DNA vi khuẩn được chuẩn bị theo quy trình của Trần Nhân Dũng và Nguyễn Vũ Linh (2011), sau đó tiến hành phản ứng PCR vùng gene 16S-rRNA bằng cặp mồi 27F và 1492R (Lane, 1991) với trình tự như sau: 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’);.
- Công cụ BLAST N được sử dụng để so sánh trình tự DNA của các dòng vi khuẩn triển vọng với trình tự DNA của bộ gene các loài vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu NCBI để định danh.
- 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh.
- Từ 50 mẫu rễ, lá và trái của cây cà phê vối thu tại huyện Ea H’leo và Krông Năng (Đắk Lắk), 100 dòng vi khuẩn đã được phân lập, trong đó 25 dòng từ rễ, 61 dòng từ lá và 14 dòng từ trái..
- Kết quả kiểm tra khả năng phát triển của 100 dòng vi khuẩn trong 72 giờ đã tuyển chọn được 50 dòng vi khuẩn phát triển tốt trên từng loại môi trường để tiếp tục theo dõi các đặc điểm khuẩn lạc và tế bào, đồng thời làm cơ sở tiến hành các thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp ammonium, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA.
- Bảng 1: Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn phân lập Đặc điểm.
- khuẩn lạc Mô tả Số lượng dòng vi khuẩn.
- Bảng 2: Đặc điểm vi khuẩn phân lập Đặc điểm.
- tế bào Mô tả Số lượng dòng vi khuẩn Tỷ lệ.
- Đa số các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, màu trắng trong, độ nổi lài, có dạng bìa nguyên, kích thước khuẩn lạc dao động từ 0,1 - 4,0 mm sau 2 ngày nuôi cấy trên 3 loại môi trường (Bảng 1).
- dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng chuyển động và tất cả đều là vi khuẩn Gram âm (Bảng 2).
- (2005) về các vi khuẩn nội sinh cây cà phê thuộc các chi Burkholderia, Acetobacter, Pseudomonas, Enterobacter… đều thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm.
- Tế bào vi khuẩn có dạng hình que hoặc hình cầu, kích thước tế bào biến động trong khoảng μm μm..
- 3.2 Khả năng tổng hợp ammonium.
- Năm mươi dòng vi khuẩn phân lập đều có khả năng tổng hợp NH 4 + từ mg/L và các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường LGIP có khả năng tổng hợp NH 4 + cao hơn so với các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường BAz và NFb.
- Từ 50 dòng vi khuẩn thử nghiệm tuyển chọn được 10 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH 4 + tốt (Bảng 3)..
- Kết quả cho thấy khả năng tổng hợp NH 4 + của 10 dòng vi khuẩn triển vọng sau 6 ngày ủ đều được phân lập trên môi trường LGIP và các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ có khả năng tổng hợp NH 4 + cao hơn các dòng vi khuẩn phân lập từ lá và trái của cây cà phê vối.
- (1997) cho biết các dòng vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây cà phê phân lập được có khả năng cố định đạm tốt..
- Bảng 3: Hàm lượng đạm do 10 dòng vi khuẩn triển vọng tổng hợp theo thời gian (mg/L NH 4.
- Dòng vi.
- vi khuẩn Ngày 4 Ngày 6 L.H137-1 Trái 0,265 abc 0,185 a L.L109-1 Lá 0,257 a-e 0,157 c-f.
- Các dòng vi khuẩn này có khuynh hướng tổng hợp NH 4 + cao vào ngày thứ 4 và giảm dần đến ngày thứ 6.
- Nguyên nhân do vi khuẩn phát triển và tăng sinh khối theo thời gian nên lượng NH 4 + tổng hợp tăng dần.
- Ngày thứ 4 thì lượng NH 4 + tổng hợp tăng cao.
- Khi lượng NH 4 + trong môi trường tăng cao vượt quá giới hạn sẽ ức chế ngược lại vi khuẩn, vi khuẩn sử dụng lượng NH 4 + có sẵn trong môi trường và không tổng hợp thêm NH 4 + nên lượng NH 4 + khảo sát.
- Nguyên nhân thứ hai là do hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường dần cạn kiệt theo thời gian ức chế sự phát triển của các dòng vi khuẩn và ức chế quá trình tổng hợp NH 4.
- Khi lượng NH 4 + trong môi trường tăng cao vượt quá giới hạn sẽ ức chế ngược lại vi khuẩn, vi khuẩn sử dụng lượng NH 4 + có sẵn trong môi trường và không tổng hợp thêm NH 4 + nên lượng NH 4 + khảo sát vào ngày thứ 6 giảm (Van and Sloger, 1981)..
- 3.3 Khả năng tổng hợp IAA.
- Kết quả thí nghiệm cho thấy 10 dòng vi khuẩn triển vọng đều có khả năng tổng hợp IAA.
- (2016) thì các dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp IAA giúp kích thích cây chủ phát triển tốt..
- Bảng 4: Hàm lượng IAA do 10 dòng vi khuẩn triển vọng tổng hợp theo thời gian (μg/mL).
- Dòng vi khuẩn Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 L.H b 18,38 b 13,95 c L.L109-1 3,63 e 7,12 f 5,39 e L.L120-2 3,04 e 2,14 g 0,63 f L.R c 15,03 d 19,21 a L.R a 17,45 bc 12,92 c L.R b 16,42 c 15,61 b L.R152-1 3,82 e 7,96 f 6,54 e L.R155-3 8,37 d 10,45 e 8,53 d L.R b 10,86 e 9,60 d L.V c 19,43 a 13,98 c.
- Ngoài khả năng tổng hợp NH 4.
- các dòng vi khuẩn phân lập được trong nghiên cứu này còn có khả năng tổng hợp IAA và dòng L.R150-1 được xem là triển vọng so với các dòng còn lại, hàm lượng IAA do dòng này tổng hợp tăng dần theo thời gian từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4 và đạt cao nhất vào ngày thứ 6 (19,21 μg/mL)..
- 3.4 Khả năng hòa tan lân khó tan.
- 3.4.1 Độ hữu hiệu của các dòng vi khuẩn hòa tan lân khó tan.
- Hai mươi sáu dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân từ dạng khó tan thành dạng dễ hấp thu và làm biến đổi màu môi trường NBRIP từ màu trắng đục sang màu vàng do chúng tiết ra các acid hữu cơ (acid gluconic, acid 2-ketogluconic.
- để hòa tan lân khó tan trong môi trường (Hình 1).
- (2017) cho thấy các dòng vi khuẩn phân lập từ cây cà phê ở phía Nam Ethiopia có khả năng hòa tan lân rất tốt.
- (2013) khi nghiên cứu các dòng vi khuẩn hòa tan lân từ cây cà phê trồng ở Tây Nam của Ethiopia.
- Chín dòng vi khuẩn phân lập được từ cây cà phê vối có khả năng hòa tan lân tốt (Bảng 5)..
- Hình 1: Vòng sáng halo của dòng vi khuẩn B.R157-2 trên môi trường NBRIP đặc Đa số các dòng vi khuẩn này có hiệu suất hòa tan lân khó tan tăng dần theo thời gian từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4 và đạt cao nhất vào ngày thứ 6.
- Một số dòng vi khuẩn có hiệu suất tăng cực đại vào ngày thứ 4 và giảm dần đến ngày thứ 6 chứng tỏ các dòng vi khuẩn này sử dụng lượng lân hòa tan để phát triển sinh khối (Imazu et al., 1998)..
- Bảng 5: Hiệu suất hòa tan lân của 9 dòng vi khuẩn triển vọng (E%).
- 3.4.2 Định lượng lân hòa tan của các dòng vi khuẩn triển vọng.
- Kết quả nghiên cứu cho thấy 9 dòng vi khuẩn triển vọng đều có khả năng hòa tan lân khó tan.
- dòng vi khuẩn có lượng lân hòa tan tăng dần theo thời gian từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 15 sau đó đó giảm dần đến ngày thứ 20.
- Hàm lượng lân hòa tan dao động từ mg/mL (Bảng 6)..
- Bảng 6: Hàm lượng lân hòa tan đo được bởi 9 dòng vi khuẩn theo thời gian.
- Dòng vi khuẩn Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15 Ngày 20.
- 3.5 Kết quả nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh.
- Ba dòng vi khuẩn triển vọng L.R150-3, B.R157- 2 và L.R150-1 có độ tương đồng 95-96% với 3 dòng vi khuẩn trong ngân hàng gene NCBI (Bảng 7)..
- Dòng vi khuẩn L.R150-3 tương đồng với vi khuẩn Kosakonia oryzae VITPSCQ3 (95.
- Kosakonia oryzae (Enterobacter oryzae) là một trong những vi khuẩn có khả năng cố định đạm (Ruppel and Merbach, 1995), tổng hợp các phytohormone như các hợp chất auxin (indole-3-acetic acid), hòa tan lân khó tan và có thể ức chế sự phát triển của một số nấm gây bệnh (Hardoim et al., 2013)..
- Bảng 7: Kết quả so sánh trình tự các dòng vi khuẩn phân lập với cơ sở dữ liệu NCBI Dòng vi.
- khuẩn Vi khuẩn tương đồng trên cơ sở dữ liệu Mức độ tương.
- Dòng vi khuẩn B.R157-2 tương đồng với vi khuẩn Burkholderia cepacia Eb-6 (96.
- đã phân lập được dòng Burkholderia cepacia từ rễ cây cà phê chè tại Colombia và sau đó, loài này cũng đã được phân lập từ cây thông đất (Lycopodium cernuum L.) trên môi trường NBRIY trong nghiên cứu của Ghosh et al.
- Burkholderia cepacia có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA cao (Ghosh et al., 2016), giúp cây trồng tăng khả năng kháng nấm bệnh từ đó giảm lượng thuốc trừ sâu sử dụng (Hebbar et al., 1998).
- Castro-Toro and Rivillas-Osorio (2002) đã sử dụng Burkholderia cepacia để kiểm soát nấm Rosellinia bunodes gây bệnh thối cổ rễ ở cây cà phê.
- Điều này cho thấy loài này có khả năng ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ sinh học và là tác nhân kiểm soát sinh học phục vụ công tác quản lý bệnh cây..
- Dòng vi khuẩn L.R150-1 tương đồng với vi khuẩn Enterobacter cloacae Klu 13f (95%)..
- Enterobacter cloacae phân lập từ lúa mì (Triticum aestivum L.) có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan μg/mL) và tổng hợp IAA tốt μg/mL) (Singh et al,.
- Năm mươi dòng vi khuẩn nội sinh từ rễ, lá, trái cây cà phê vối trồng tại tỉnh Đắk Lắk đã được phân lập và tuyển chọn.
- Ba dòng vi khuẩn triển vọng L.R150-3, B.R157-2 và L.L150-1 được nhận diện theo thứ tự là Kosakonia sp.
- Các thí nghiệm đồng ruộng ứng dụng 3 dòng vi khuẩn này cần được thực hiện trước khi tiến.
- hành sản xuất phân bón vi sinh cho cây cà phê vối trồng ở tỉnh Đắk Lắk.
- Cà phê Việt Nam những năm qua..
- Phát hiện vi khuẩn Azospirillum lipoferum nội sinh trong cây lúa mùa cao sản (Oryza sativa L.) trồng ở Đồng bằng sông Cửu Long.
- Cây cà phê ở Việt Nam.
- Phân lập và nhận diện một số chủng vi khuẩn cố định nitơ trên cây bắp.
- Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh để sản xuất phân vi sinh ở quy mô phòng thí nghiệm cho cây mía trồng tại tỉnh Sóc Trăng