Xác định mầm bệnh gây thối đồng tiền trên khoai lang tím Nhật tại huyện Bình Tân, Vĩnh Long

- XÁC ĐỊNH MẦM BỆNH GÂY THỐI ĐỒNG TIỀN.
- 16S rRNA, định danh, khoai lang tím, Klebsiella variicola, rpoB, thối đồng tiền.
- Tuber rot (“thối đồng tiền” in Vietnamese) is currently present in sweet potato fields of Bình Tân, Vĩnh Long of Vietnam.
- Bệnh thối đồng tiền đang gây hại khoai lang tím Nhật tại huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long.
- Tổng số 32 chủng vi khuẩn đã được phân lập từ 18 mẫu bệnh thu thập ở 3 xã Thành Đông, Thành Trung và Tân Thành (huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long).
- Sau khi thực hiện quy trình Koch, 5 chủng vi khuẩn BT5, BT14, BT15, BT19, BT30 gây vết bệnh thối đồng tiền giống triệu chứng quan sát ngoài đồng.
- Mầm bệnh được xác định là vi khuẩn Klebsiella variicola thông qua đặc điểm hình thái, sinh hóa và kỹ thuật sinh học phân tử.
- Việc phân tích trình tự gen 16S rRNA (liên quan đến quá trình phát sinh loài) và gen rpoB (có trình tự chuyên biệt cho mỗi loài thuộc chi Klebsiella) giúp phân biệt được vi khuẩn K.
- Xác định mầm bệnh gây thối đồng tiền trên khoai lang tím Nhật tại huyện Bình Tân, Vĩnh Long.
- Khoai lang (Ipomoea batatas) là cây lương thực phổ biến đứng thứ bảy trên thế giới (Kays et al.,.
- Calvo et al., 2010).
- kinh tế sau khoai tây (Vu et al., 2000).
- Đặc biệt bệnh thối đồng tiền trên khoai lang tím ở huyện Bình Tân trong nhiều năm qua đã gây thiệt hại nghiêm trọng đến chất lượng thương phẩm củ.
- Do đó, việc xác định mầm bệnh thối đồng tiền trên khoai lang tím Nhật là rất cần thiết, để tìm ra những biện pháp phòng trị bệnh theo hướng sinh học, mang lại hiệu quả cao mà không ảnh hưởng đến môi trường..
- 2.1 Thu thập mẫu bệnh thối đồng tiền trên khoai lang tím Nhật.
- 2.2 Phân lập mầm bệnh.
- Tác nhân gây bệnh có thể là nấm hoặc vi khuẩn nên mẫu bệnh được tiến hành phân lập trên hai môi trường potato dextrose agar (PDA) (đối với mầm bệnh nấm) và nutrient agar (NA) (đối với mầm bệnh vi khuẩn)..
- 2.2.2 Đối với mầm bệnh vi khuẩn.
- Trải đều 30 µL dịch vi khuẩn trên bề mặt môi trường NA bằng que tam giác đến khi bề mặt môi trường khô hoàn toàn.
- Thành phần môi trường gồm 5 g peptone, 3 g beef extract, 5 g NaCl, 20 g agar và nước cất vừa đủ 1 lít, pH 6,8 (Shivaji et al., 2006).
- 2.3 Xác định mầm bệnh thối đồng tiền trên khoai lang tím Nhật theo quy trình Koch.
- Vì thế, tác nhân gây bệnh thối đồng tiền trên khoai lang tím có thể liên quan đến vi khuẩn..
- Huyền phù các chủng vi khuẩn được chuẩn bị bằng cách hòa tan khuẩn lạc nuôi cấy trên NA trong 48 giờ ở nhiệt độ 28 ± 2C với nước cất vô trùng.
- Huyền phù vi khuẩn được điều chỉnh về mật số 10 8 CFU/mL bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ (OD) ở bước sóng 600 nm tương ứng với giá trị 0,13 A..
- Củ khoai lang tím Nhật sạch bệnh được thu từ các ruộng khoai đang thu hoạch tại huyện Bình Tân, Vĩnh Long.
- Dùng micropipette bơm 50 µL huyền phù vi khuẩn vào vị trí đã tạo vết thương.
- Các chủng vi khuẩn gây vết bệnh giống với vết bệnh thu thập ngoài đồng sẽ được tiến hành định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA và rpoB kết hợp với khảo sát đặc điểm hình thái và sinh hóa dựa theo hệ thống phân loại Bergey (Holt et al., 1994)..
- 2.4 Định danh mầm bệnh.
- Giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn DNA của các chủng vi khuẩn được ly trích dựa theo quy trình được mô tả bởi Sambrook et al..
- Đoạn gen 16S rRNA được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi tổng 27F (5- AGAGTTTGATCCTGGCTC-3) và 1492R (5- TACGGTTACCTTGTTACGACT-3) (Weisburg et al., 1991).
- Trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn được so sánh với các trình tự đã công bố trên ngân hàng dữ liệu GenBank của NCBI bằng công cụ Blastn.
- Giải trình tự gen rpoB của vi khuẩn.
- (Diancourt et al., 2005).
- Giai đoạn kéo dài ở 72C trong 5 phút (He et al., 2016).
- Trình tự gen rpoB của vi khuẩn được sử dụng để xây dựng cây phả hệ theo phương pháp Neighbor joining sử dụng phép toán Jukes-Cantor model với độ lặp lại 2.000 lần bằng phần mềm MEGA 6.06 (He et al., 2016)..
- Khảo sát khả năng di động được thực hiện trong môi trường NA (0,3% agar) theo mô tả của Trüper và Schleifer (2006).
- Khảo sát khả năng lên men các loại đường được thực hiện bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường gồm 10 g peptone, 5 g NaCl, 1 g beef extract, 0,018 g bromothymol blue, nước cất vừa đủ 1 L, pH 7,1 và 1 g đường cần khảo sát (MacFaddin, 2000)..
- 3.1 Thu thập và phân lập mầm bệnh thối đồng tiền trên khoai lang tím Nhật.
- Tổng số 32 chủng vi khuẩn được phân lập từ 18 mẫu bệnh thối đồng tiền thu thập tại huyện Bình Tân, Vĩnh Long (14 chủng từ xã Tân Thành, 10 chủng từ xã Thành Trung và 8 chủng từ xã Thành Đông).
- Số lượng các chủng vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng và trắng là chủ yếu.
- Các khuẩn lạc hình tròn, bề mặt ướt và có màu trắng đục chiếm tỷ lệ nhiều nhất (50%) và phân bố đều khắp ba xã nên có khả năng đây là những chủng vi khuẩn gây bệnh..
- Để thực hiện quy trình Koch, các chủng vi khuẩn được chủng bệnh nhân tạo trên củ khoai lang tím Nhật trong điều kiện phòng thí nghiệm dựa theo phương pháp của Umunna và Anselem (2014).
- Sau khi ủ ở nhiệt độ 30 ± 2C trong 21 ngày, 9 chủng trong 32 chủng vi khuẩn có biểu.
- Tuy nhiên, 4 chủng có vết bệnh trên bề mặt củ không giống với triệu chứng điển hình của bệnh thối đồng tiền.
- Đây có thể là các chủng vi khuẩn cơ hội, sống hoại sinh xâm nhập và phát triển cùng với mầm bệnh gây thối đồng tiền..
- vết bệnh giống hoàn toàn (vết lõm tại vị trí tiêm và lan ra tạo thành những vết gần tròn, màu vàng nâu) và 3 chủng BT5, BT14 và BT15 cho vết bệnh có biểu hiện gần giống (vết lõm ít lan rộng và màu sắc vết bệnh sậm hơn) (Hình 1) với vết bệnh thối đồng tiền ngoài đồng..
- Ngoài ra, sự khác nhau về thành phần dinh dưỡng trong khoai lang tím khi đang trong giai đoạn tạo củ và lúc trưởng thành cũng ảnh hưởng đến sự biểu hiện bệnh của các chủng vi khuẩn.
- Kết quả chủng bệnh nhân tạo trong điều kiện nhà lưới cho thấy cả ba chủng BT5, BT14 và BT15 cho vết bệnh giống với bệnh thối đồng tiền ngoài đồng (các vết lõm vào tại vị trí tiêm và lan ra tạo thành những vết gần tròn, bên trong vết bệnh có màu vàng nâu đặc trưng) (Hình 2)..
- Kết quả quan sát khuẩn lạc tròn, bề mặt trơn ướt, nổi và có màu trắng đục đặc trưng trên môi trường NA (Hình 3), hoàn toàn giống với khuẩn lạc của vi khuẩn đã chủng bệnh ban đầu trong quy trình Koch, dễ dàng phân biệt với các chủng vi khuẩn tạp nhiễm trên mẫu bệnh trong quá trình tái phân lập.
- Như vậy, sau khi thực hiện quy trình Koch trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới, 5 chủng vi khuẩn BT19, BT30, BT5, BT14 và BT15 được xác định là tác nhân gây bệnh thối đồng tiền trên khoai lang tím Nhật tại huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long..
- Chủng vi khuẩn BT14 được chọn đại diện để thực hiện định danh..
- Hình 3: Hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn BT14.
- Được phân lập từ mẫu bệnh thối đồng tiền thu thập tại xã Thành Trung, huyện Bình Tân, Vĩnh Long (A) và khi được tái phân lập (B) trên môi trường nutrient agar từ mẫu củ khoai lang chủng bệnh thối đồng tiền.
- 3.3 Định danh vi khuẩn gây bệnh thối đồng tiền Tác nhân gây bệnh thối đồng tiền được định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử (giải trình tự.
- DNA của chủng vi khuẩn BT14 được ly trích và khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi tổng 27F/1492R (Weisburg et al., 1991)..
- Kích thước sản phẩm khoảng 1.500 bp phù hợp kết quả nghiên cứu của Weisburg et al.
- Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA của chủng BT14 có độ dài 1.111 bp.
- Sau khi so sánh với các trình tự trên cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI bằng công cụ Blastn, trình tự gen 16S rRNA của hai loài vi khuẩn Klebsiella pneumoniae và K..
- pneumoniae có khả năng lên men đường D -adonitol còn K..
- variicola thì không có khả năng này (Rosenblueth et al., 2004).
- Tuy nhiên, trong nghiên cứu của He et al.
- Gen rpoB mã hóa cho tiểu đơn vị β-RNA polymerase được sử dụng như một công cụ định danh vi khuẩn và phân tích cây phả hệ (Drancourt and Raoult, 2005).
- DNA của chủng BT14 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi VIC2 và VIC3 (Diancourt et al., 2005).
- Kích thước sản phẩm khoảng 1.000 bp (Hình 5) phù hợp kết quả nghiên cứu của Diancourt et al.
- Hình 5: Kết quả điện di sản phẩm PCR của chủng BT14 bằng cặp mồi VIC3 và VIC2 (Diancourt et al., 2005) trên gel agarose 1,5%.
- (3) và (4) chủng BT14 Kết quả giải trình tự gen rpoB của chủng BT14.
- Các trình tự gen rpoB tham khảo từ nghiên cứu của He et al.
- Trình tự gen rpoB của chủng Agrobacterium.
- Nhóm 1 gồm các chủng vi khuẩn thuộc loài K.
- sở dữ liệu GenBank (NCBI) được ghi trong ngoặc đơn Theo Rosenblueth et al.
- không có khả năng lên men đường D -adonitol.
- variicola lại có khả năng này (Brisse et al., 2004.
- Alves et al., 2006.
- Winn et al., 2006).
- chỉ dựa vào khả năng lên men đường D -adonitol thì có thể dẫn đến việc xác định nhầm lẫn tên giữa vi khuẩn K.
- pneumoniae có khả năng gây bệnh trên người, dẫn đến những lo ngại không đáng có (Liam et al., 2001.
- Paganin et al., 2004)..
- Do đó, việc phân biệt hai vi khuẩn K.
- Trong các phương pháp định danh vi khuẩn.
- Tuy nhiên, quá trình định danh vi khuẩn dựa vào độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA chỉ cho kết quả định danh chính xác đến mức độ trên loài, như trường hợp định danh chủng vi khuẩn CT-78 đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.
- nematodiphila (Khoa et al., 2016).
- Trong nghiên cứu này, trình tự gen 16S rRNA chủng BT14 có độ tương đồng 98% với trình tự gen 16S rRNA của 2 loài vi khuẩn K.
- variicola và chỉ có thể phân biệt thông qua phương pháp phân tích cây phả hệ gen rpoB (He et al., 2016).
- Bên cạnh đó, nhằm thêm phần khẳng định kết quả định danh mầm bệnh, khảo sát sinh hóa đặc trưng và cơ bản của chi Klebsiella đã được thực hiện như nhuộm Gram, kiểm tra khả năng di động, khả năng lên men đường L -arabinose và D - glucose cho thấy chủng vi khuẩn BT14 là vi khuẩn Gram âm, hình que, không có khả năng di động và có khả năng lên men đường L -arabinose và D - glucose (Hình 7A-B, 7D-E)..
- pneumoniae (Rosenblueth et al., 2004.
- He et al., 2016).
- variicola là vi khuẩn Gram âm, hình que, không di động, thuộc họ Enterobacteriaceae (Janda and Abbott, 2006;.
- variicola chủ yếu được tìm thấy trong thực vật như chuối, gạo, mía và ngô (Rosenblueth et al., 2004.
- Alves et al., 2006)..
- Chúng có khả năng cố định đạm (Rosenblueth et al., 2004.
- Wei et al., 2014.
- Lin et al., 2015).
- variicola đã được báo cáo là mầm bệnh gây thối mềm trên chuối ở Trung Quốc (Fan et al., 2016).
- Từ 18 mẫu bệnh thối đồng tiền trên khoai lang tím Nhật thu thập ở huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long, 32 chủng vi khuẩn đã được phân lập.
- chứng không điển hình của bệnh thối đồng tiền khi chủng bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm để thực hiện quy trình Koch.
- Trong điều kiện nhà lưới, 3 chủng BT5, BT14 và BT15 đều cho các vết bệnh giống với triệu chứng thối đồng tiền ngoài ruộng.
- Kết quả này cho thấy cả 5 chủng trên đều được xác định là tác nhân gây bệnh thối đồng tiền..
- Mầm bệnh được xác định là vi khuẩn Klebsiella variicola bằng kỹ thuật sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S rRNA và rpoB) kết hợp khảo sát đặc điểm hình thái và sinh hóa..
- Phân lập, định danh và khảo sát khả năng phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa của vi khuẩn đối kháng trong đất hai tỉnh Tiền Giang và Sóc Trăng.
- Khoai lang Bình Tân, ngày truy cập 9/6/2016