- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG NẤM BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY VẬT LIỆU HỮU CƠ TỪ ĐẤT NÔNG NGHIỆP Ở TỈNH SÓC TRĂNG Quách Thị Trúc Ly 1 và Nguyễn Khởi Nghĩa 2*. - Mục tiêu của nghiên cứu nhằm phân lập một số dòng nấm từ 14 hệ vi sinh vật bản địa trên hệ cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng có khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ. - Kết quả cho thấy có 56 dòng nấm được phân lập, trong đó 36 dòng có đường kính vòng halo dao động từ 1,67 mm đến 25,7 mm. - Hoạt độ enzyme của 10 dòng nấm tuyển chọn dao động từ 2,52 đến 16,5 UI/mL/h. - Các dòng nấm phân hủy rơm, bồn bồn và lục bình cao nhất lần lượt gồm H3-1 (59,13. - Dòng nấm H7-4 phân hủy tốt cả 3 loại vật liệu thí nghiệm với tỉ lệ lần lượt và 47,9%. - Phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm bản địa có khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ từ đất nông nghiệp ở tỉnh Sóc Trăng. - Như vậy, việc nghiên cứu tuyển chọn các dòng nấm bản địa có khả năng phân giải nhanh phụ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose sẽ mang lại nhiều lợi ích thiết thực trong hoạt động nông nghiệp. - Trước tiên, việc sử dụng các dòng nấm phân hủy nhanh phụ phế phẩm nông nghiệp hữu cơ giúp làm giảm ô nhiễm môi trường khu vực nông thôn tại địa phương và giúp làm giảm phát thải khí gây hiệu ứng nhà kính. - Bên cạnh đó, việc sử dụng các dòng nấm bản địa phân hủy tốt các phụ phế phẩm nông nghiệp hữu cơ để tạo ra một dạng phân hữu cơ cung cấp dinh dưỡng thiết yếu cho đất và cây trồng, góp phần xây dựng một nông nghiệp sạch, hữu cơ và bền vững cho tỉnh Sóc Trăng. - Do đó, nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm bản địa trong hệ vi sinh vật bản địa thu thập từ đất canh tác nông nghiệp có mô hình cây trồng khác nhau trong tỉnh Sóc Trăng có khả năng phân hủy nhanh vật liệu hữu cơ chứa cellulose là cần thiết và có ý nghĩa quan trọng.. - 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phân lập một số dòng nấm từ các hệ vi sinh vật đất bản địa trên các mô hình canh tác cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng. - 2.1.2 Phân lập nấm phân hủy vật liệu hữu cơ chứa cellulose. - Tiếp theo các dòng nấm phân lập được tách ròng bằng cách cấy chuyền liên tục 5 lần trên môi trường nuôi cấy PDA để đạt các dòng nấm thuần. - 2.2 Định tính khả năng tổng hợp enzyme cellulase của các dòng nấm phân lập. - Các dòng nấm phân lập được nuôi cấy trên môi trường PDA trong hai ngày, trong tối và ở điều kiện phòng thí nghiệm.. - 2.3 Định lượng khả năng tổng hợp enzyme cellulase của 10 dòng nấm tuyển chọn trong môi trường nuôi cấy lỏng. - Mười dòng nấm được chọn trong thí nghiệm này thuộc các nhóm có đường kính vòng halo cao (gồm các dòng H7-4, H3-1, H9-6, H4-7 và H7-3), đường kính vòng halo trung bình (dòng H1-2), đường kính vòng halo thấp (dòng H2-1) và không tạo vòng halo (gồm dòng H10-5, H11-2 và H13-1) được nuôi cấy trên môi trường PDA trong hai ngày, trong tối và ở điều kiện phòng thí nghiệm.. - Thí nghiệm được thực hiện với ba lần lặp lại cho mỗi dòng nấm.. - 2.4 Khả năng phân hủy một số vật liệu hữu cơ chứa cellulose tiệt trùng của 10 dòng nấm phân lập được tuyển chọn. - Qui trình chuẩn bị nguồn nấm cho mười dòng nấm ký hiệu H7-4, H3-1, H9-6, H4-7, H7-3, H1-2, H2-1, H10-5, H11-2 và H13-1 được thực hiện tương tự mục 2.3.1.. - Thí nghiệm được bố trí với 3 lần lặp lại cho mỗi dòng nấm cho mỗi vật liệu hữu cơ tương ứng với 3 bình tam giác chứa mẫu. - của vật liệu hữu cơ giảm do nấm phân hủy theo công thức sau:. - Phần trăm phân hủy vật liệu hữu cơ. - 2.5 Giải mã trình tự đoạn gene 28S rRNA của bốn dòng nấm tuyển chọn. - Kết quả giải trình tự đoạn gen sẽ được nhận dạng trên ngân hàng gene NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi để xác định tên loài của bốn dòng nấm tuyển chọn.. - 3.2 Phân lập các dòng nấm phân hủy cellulose từ các hệ vi sinh vật vật đất bản địa ở nhiều mô hình canh tác cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng. - Từ 14 mẫu cộng đồng vi sinh vật (IMO) đất bản địa thu từ đất nông nghiệp với các mô hình canh tác khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng đã phân lập được 56 dòng nấm có tiềm năng phân hủy vật liệu hữu cơ chứa cellulose. - Hình 1: Hình dạng và màu sắc khuẩn lạc điển hình của một số dòng nấm phân lập Màu sắc khuẩn lạc: khuẩn lạc nấm có màu sắc rất đa dạng như màu trắng, màu đen, màu vàng, màu nâu, màu xám và màu xanh. - Hình thái bào tử và hệ sợi của 10 dòng nấm tuyển chọn. - Mười dòng nấm H7-4, H3-1, H9-6, H4-7, H7-3, H1-2, H2-1, H10-5, H13-1 và H11-2 đều là các dòng nấm thuộc chi Aspergillus (dựa vào hình thái cuống bào tử). - 3.3 Định tính khả năng tổng hợp enzyme cellulase của các dòng nấm phân lập. - Kết quả định tính khả năng tổng hợp enzyme cellulase của 56 dòng nấm phân lập trên môi trường BHM agar có bổ sung 1% CMC sau 3 ngày nuôi cấy có 36 dòng nấm (Bảng 3) có khả năng tổng hợp enzyme cellulase với đường kính vòng halo tạo thành khác nhau và 20 dòng nấm không tạo vòng halo mặc dù các dòng nấm này phát triển và tạo hệ sợi nấm rất nhanh trên bề mặt môi trường. - Đường kính vòng halo được tạo ra bởi 36 dòng nấm khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau và dao động từ 1,67 mm đến 25,7 mm. - Cụ thể, ba dòng nấm kí hiệu H7-4, H3-1 và H9-6 có đường kính vòng halo lớn nhất lần lượt đạt 25,7 mm, 24 mm và 22 mm (Hình 3). - Ngoài ra, còn có 14 dòng nấm ký hiệu H1-2, H2-3, H2-4, H2-5, H3-3, H3-4, H4-1, H4-5, H4-6, H4-7, H7-2, H7-3, H9-2 và H9-3 có đường kính vòng halo dao động từ 10mm đến 20mm và 19 dòng nấm ký hiệu H1-1, H2-1, H2-2, H3-2, H4-2, H4-3, H4-4, H5-1, H5-1, H6-1, H6-2, H6-3, H6-5, H7-1, H8-1, H8-4, H9-1, H9-4 và H9-5 có đường kính vòng halo dưới 10 mm. - (2014) cho thấy dòng nấm chủng 10 có đường kính vòng phân giải đạt 11 mm sau 4 ngày thí nghiệm, trong khi đó có rất nhiều dòng nấm trong nghiên cứu này có đường kính vòng phân giải cao hơn rất nhiều, đặc biệt là dòng nấm H7-4 có đường kính vòng phân giải đạt 25,7 mm cao hơn gấp 2 lần so với chủng nấm 10. - Dựa vào kết quả đường kính vòng halo của các dòng nấm phân lập ở Bảng 3 đã chọn ra 5 dòng nấm có đường kính vòng halo cao nhất (gồm H7-4, H3-1, H9-6, H7-3 và H4-7), 1 dòng nấm có đường kính vòng halo trung bình và thấp (gồm H1-2 và H2-1) và 3 dòng nấm không tạo vòng halo gồm (H10-5, H13-1 và H11-2) để thí nghiệm tiếp theo.. - Hình 3: Đường kính vòng phân giải của 3 dòng nấm tuyển chọn. - Bảng 3: Đường kính vòng halo phân giải cellulose của 36 dòng nấm phân lập. - STT Dòng nấm Đường kính vòng halo (mm) STT Dòng nấm Đường kính vòng halo (mm). - 3.4 Định lượng khả năng tổng hợp enzyme cellulase của 10 dòng nấm phân lập được tuyển chọn trong môi trường nuôi cấy lỏng. - Kết quả định lượng khả năng tổng hợp enzyme cellulase của 10 dòng nấm tuyển chọn trong môi trường BHM lỏng chứa 1% CMC được trình bày ở Hình 4. - Nhìn chung, hoạt độ enzyme cellulase do 10 dòng nấm tổng hợp khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nhau và dao động từ 2,52 đến 16,5 UI/mL/h. - Trong đó, 3 dòng nấm cho hoạt độ enzyme cao nhất gồm H4-7, H7-3 và H9-6 với hoạt độ emzyme cellulase lần lượt đạt và 15,28 UI/mL/h. - của 3 dòng nấm H11-2, H10-5 và H13-1 thấp nhất và lần lượt đạt và 2,52 UI/mL/h. - So với các nghiên cứu trước đây hoạt độ enzyme cellulase của 3 dòng nấm H9-6, H4-7 và H7-3 cao hơn đáng kể. - Cụ thể ở nghiên cứu của Acharya and Modi (2008) cho thấy hoạt độ enzyme cellulase của dòng nấm Aspergillus niger đạt cao nhất ở 0,0925 UI/mL sau 96 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 28 o C. - Hình 4: Hàm lượng enzyme cellulase trong môi trường BHM 1%CMC lỏng của 10 dòng nấm tuyển chọn (n = 3, độ lệch chuẩn). - 3.5 Khả năng phân hủy rơm, lá bồn bồn và lục bình tiệt trùng của 10 dòng nấm phân lập. - Kết quả đánh giá khả năng phân hủy rơm sau 30 ngày thí nghiệm của 10 dòng nấm phân lập và chế phẩm Trichoderma sp. - Hình 5: Phần trăm phân hủy ba vật liệu hữu cơ tiệt trùng (rơm, lá bồn bồn và lục bình) của 10. - dòng nấm thử nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy (n=3, độ lệch chuẩn). - Nhìn chung, tất cả 10 dòng nấm thử nghiệm đều có khả năng phân hủy rơm cao hơn và khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng. - Khả năng phân hủy rơm của 10 dòng nấm thử nghiệm dao động từ 34,53%. - Trong đó dòng nấm H3-1 có phần trăm phân hủy rơm cao nhất, đạt 59,13% và khác biệt có nghĩa thống kê so với các dòng nấm còn lại (dao động từ 33,2. - của Đại học Cần Thơ phân hủy 37,53% trọng lượng rơm khô sau 30 ngày thí nghiệm, thấp hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê so với dòng nấm H3-1. - (2017) cho thấy dòng nấm mốc 6NH phân lập ở bãi rác tỉnh Thừa Thiên Huế sau 45 ngày thí nghiệm phân hủy được 47,39% trọng lượng rơm khô thấp. - hơn dòng nấm kí hiệu H3-1 trong nghiên cứu này.. - Tóm lại, cả 10 dòng nấm thử nghiệm đều có khả năng phân hủy rơm cao và dòng nấm H3-1 là dòng thể hiện khả năng phân hủy cao nhất đối với vật liệu rơm và do đó, được chọn để định danh.. - Như vậy, hoạt độ enzyme cellulase và phần trăm phân hủy rơm của 10 dòng nấm tuyển chọn không có mối tương quan với nhau. - Kết quả cho thấy rằng enzyme cellulase không phải là enzyme then chốt tham gia vào việc phân hủy rơm lúa và việc phân hủy rơm lúa bởi các dòng nấm thử nghiệm được quyết định chủ yếu bởi các enzyme khác, bên cạnh enzyme cellulase.. - Kết quả khảo sát khả năng phân hủy lá bồn bồn sau 30 ngày thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm của 10 dòng nấm phân lập và chế phẩm nấm Trichoderma sp. - của Trường Đại học Cần Thơ được trình bày ở Hình 5 cho thấy tất cả 10 dòng nấm thử nghiệm đều có khả năng phân hủy lá bồn bồn cao, cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) khi so sánh với nghiệm thức đối chứng.. - Khả năng phân hủy lá bồn bồn của 10 dòng nấm thử nghiệm dao động từ 27,87% đến 78,27%. - Dòng nấm H9-6 thể hiện khả năng phân hủy lá bồn bồn cao nhất, đạt 78,27%, kế đến là dòng nấm H7-4, đạt 68,7% và thấp nhất là dòng nấm H13-1 có tỉ lệ phân hủy đạt 27,87%. - Các dòng nấm còn lại có tỉ lệ phân hủy lá bồn bồn dao động từ 38,2% đến 60,3%. - của Đại học Cần Thơ phân hủy được 45,87% trọng lượng lá bồn bồn khô sau 30 ngày thí nghiệm, thấp hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê so với dòng nấm H9-6. - Tóm lại, cả 10 dòng nấm thử nghiệm đều có khả năng phân hủy cao lá bồn bồn. - Dòng nấm H9-6 bên cạnh thể hiện khả năng phân hủy cao đối với vật liệu lá bồn bồn còn phân hủy cao vật liệu rơm và do đó, dòng nấm H9-6 được chọn để định danh.. - Kết quả phân tích tương quan với hệ số tương quan r = 0,68 cho thấy giữa hoạt độ enzyme cellulase và phần trăm phân hủy lá bồn bồn của 10 dòng nấm tuyển chọn có tương quan thuận và enzyme cellulase có vai trò quan trọng và then chốt quyết định khả năng phân hủy bồn bồn bên cạnh một số enzyme khác.. - Kết quả khảo sát khả năng phân hủy lục bình sau 30 ngày của 10 dòng nấm phân lập và chế phẩm nấm Trichoderma sp. - Phần trăm phân hủy lục bình của 10 dòng nấm thứ nghiệm dao động từ 18,9% đến 63,1%. - Trong đó dòng nấm nấm H4-7 cho khả năng phân hủy lục bình cao nhất, đạt 63,13%, kế đến dòng nấm H7-4 có khả năng phân hủy 47,9%. - Đứng hàng thứ ba trong nhóm cao nhất là dòng nấm H7-4 có tỉ lệ phân hủy lục bình đạt 39,7%.. - của Đại học Cần Thơ phân hủy 35,53% trọng lượng lục bình khô sau 30 ngày thí nghiệm, thấp hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê so với ba dòng nấm H4-7, H7-4 và H9-6. - Ngoài ra, dòng nấm H7- 4 thể hiện khả năng phân hủy bồn bồn cao bên cạnh phân hủy lục bình. - Vì vậy dòng nấm H7-4 được chọn để định danh tên loài.. - Kết quả phân tích tương quan với hệ số tương quan r = 0,39 cho thấy giữa hoạt độ enzyme cellulase và phần trăm phân hủy lục bình của 10 dòng nấm thử nghiệm sau 30 ngày thí nghiệm không tìm thấy bất cứ mối tương quan nào. - Do đó, enzyme cellulase không phải là enzyme then chốt tham gia vào việc phân hủy lục bình và việc phân hủy lục bình bởi các dòng nấm thử nghiệm được quyết định chủ yếu bởi các enzyme khác, bên cạnh enzyme cellulase.. - Từ kết quả phân hủy lục bình và rơm lúa cho thấy cả 10 dòng nấm thử nghiệm đều có tỉ lệ phân hủy thấp và chậm hơn so với kết quả phân hủy lá bồn bồn. - Điều này ảnh hưởng đến tốc độ phân hủy của hai vật liệu này của 10 dòng nấm thử nghiệm. - Tóm lại, kết quả khảo sát khả năng phân hủy 3 vật liệu hữu cơ đã cho thấy các dòng nấm phân hủy tốt nhất đối với vật liệu lá bồn bồn, kế đến là vật liệu rơm và cuối cùng là lục bình. - Trong đó dòng nấm kí hiệu là H9- 6 phân hủy tốt nhất vật liệu lá bồn bồn với tỉ lệ chất khô bị phân hủy cao, đạt 78,3%. - Dòng nấm kí hiệu. - chất khô bị phân hủy và dòng nấm H4-7 phân hủy lục bình tốt nhất, đạt 63,1%. - Ngoài ra, dòng nấm H7-4 phân hủy tốt, ổn định cả 3 vật liệu thử nghiệm gồm rơm, lá bồn bồn và lục bình với phần trăm phân hủy lần lượt đạt và 47,9%. - Do đó 4 dòng nấm kí hiệu là H3-1, H4-7, H7-4 và H9- 6 được chọn giải trình tự đoạn gen mã hóa bán đơn vị 28S ARN ribosomes.. - 3.6 Định danh bốn dòng nấm H9-6, H7-4, H4-7 và H3-1 phân hủy tốt vật liệu hữu cơ bằng phương pháp giải mã trình tự đoạn 28S rRNA. - Kết quả giải mã trình tự đoạn gene 28S rRNA của bốn dòng nấm cho thấy dòng nấm H9-6 tương đồng với đoạn 28S rRNA của loài nấm Aspergillus oryzae với độ tương đồng là 100%, và cả ba dòng nấm H3-1, H4-7 và H7-4 tương đồng với đoạn 28S rRNA của loài nấm Aspergillus niger với tính đồng hình lần lượt là 100%, 99% và 100% (Bảng 4). - Các kết quả nghiên cứu trước đây dòng nấm Aspergillus niger và Aspergillus ozyrae được chứng minh có khả năng phân hủy cellulose nhanh và đồng thời có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp các enzyme glucosidase ứng dụng chế biến thực phẩm, sản xuất gluconic acid, định lượng glucose trong quá trình lên men và chẩn đoán trong y học (Liu et al., 1999. - (2015) việc sử dụng chế phẩm sinh học có chứa dòng nấm như Aspergillus ozyrae, Aspergillus niger làm tăng hiệu quả ủ phân hữu cơ sau 30 ngày thí nghiệm, tăng tỉ lệ N tổng số lên 1,04%, P 2 O 5 hữu hiệu là 187,9 mg/100 g và K 2 O hữu hiệu đạt 416,2 mg/100 g. - Tóm lại, bốn dòng nấm được định danh là Aspergillus ozyrae H9-6, Aspergillus niger H3-1, Aspergillus niger H4-7 và Aspergillus niger H7-4 có ích cho cây trồng và có triển vọng rất lớn trong việc sản xuất phân bón hữu cơ và sinh học cho cây trồng.. - Bảng 4: Kết quả định danh bốn dòng nấm H9-6, H7-4, H4-7 và H3-1 theo độ tương đồng của đoạn 28S rRNA. - Các dòng nấm trên cơ sở dữ liệu Định danh. - Bốn dòng nấm có kí hiệu H3-1, H4-7, H7-4 và H9-6 được phân lập từ đất hệ vi sinh vật đất bản. - 13,8 và 15,28 UI/mL/h đồng thời có khả năng phân hủy rất cao 3 vật liệu hữu cơ chứa cellulose gồm rơm, lá bồn bồn và lục bình, đặc biệt 3 dòng nấm H4-7, H7-4 và H9-6 có khả năng phân hủy cao và ổn định đối với cả 3 nguồn vật liệu. - Bốn dòng nấm này được định danh theo thứ tự lần lượt Aspergillus niger H3-1, Aspergillus niger H4-7, Aspergillus niger H7-4 và Aspergillus oryzae H9-6. - Các dòng nấm này có tiềm năng ứng dụng cao trong xử lý các phụ phế phẩm nông nghiệp để làm phân bón hữu cơ giúp cải tạo đất, tăng sinh trưởng, năng suất và chất lượng cây trồng.. - Phân lập và tuyển chọn một số dòng nấm bản địa phân hủy một số vật liệu hữu cơ từ nền đất thâm canh lúa tại xã Phong Hòa huyện Lai Vung tỉnh Đồng Tháp