Tuyển chọn và ứng dụng dòng vi khuẩn lactic lên men dưa bồn bồn (Typha orientalis) muối chua

- TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG DÒNG VI KHUẨN LACTIC LÊN MEN DƯA BỒN BỒN (Typha orientalis) MUỐI CHUA.
- Bồn bồn, Lactobacillus plantarum, lên men, tối ưu hóa, vi khuẩn lactic.
- Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn và định danh được dòng vi khuẩn lactic có khả năng sinh ra hàm lượng acid lactic cao từ cây bồn bồn (Typha orientalis), đồng thời ứng dụng lên men dưa bồn bồn và tìm ra nghiệm thức tối ưu cho quá trình lên men đạt hiệu quả cao.
- Từ nguồn mẫu bồn bồn được thu tại tỉnh Cà Mau, dòng CMT2 cho hàm lượng acid cao nhất được tuyển chọn trong 21 dòng vi khuẩn lactic được phân lập.
- Sau 6 ngày lên men dưa bồn bồn, thông qua phần mềm Design Expert 7.0 với mô hình Box–Behnken, đã xác định được nghiệm thức tối ưu cho quá trình lên men dưa bồn bồn là pH 4,87, nồng độ muối 4,08%, mật số vi khuẩn 5,1 x 10 8 tế bào/mL với hàm lượng lactic acid đạt 5,71 g/L..
- Tuyển chọn và ứng dụng dòng vi khuẩn lactic lên men dưa bồn bồn (Typha orientalis) muối chua..
- Hiện nay, để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng, các sản phẩm lên men đã và đang được nghiên.
- Một trong những sản phẩm lên men phổ biến trên thế giới cũng như ở Việt Nam đó là rau củ muối chua, một loại thực phẩm.
- Vi khuẩn lactic (LAB – lactic acid bacteria) có ứng dụng khá rộng rãi trong thực tiễn và có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm và công nghiệp hóa chất (Mazzoli et al., 2014).
- Chúng là nhóm vi khuẩn được ứng dụng nhiều trong lên men các sản phẩm dưa muối chua, là nhóm vi khuẩn có lợi cho con người, giúp kích thích hoạt động hệ miễn dịch và cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột có lợi cho sức khỏe (El Sheikha et al., 2018;.
- Trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều đề tài nghiên cứu ứng dụng các dòng vi khuẩn lactic trong lên men nhiều loại rau củ quả như: bắp cải, cải thảo, củ hành, tỏi, củ kiệu,… và nhiều loại rau củ khác (Lâm Thị Việt Hà và Nguyễn Văn Mười, 2006.
- Trên cơ sở đó, nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn, xác định khả năng sinh lactic acid của các dòng vi khuẩn lactic được phân lập từ cây bồn bồn nhằm chọn ra được dòng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic cao và ứng dụng chúng vào quá trình lên men dưa bồn bồn muối chua.
- 2.2 Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn lactic từ cây bồn bồn.
- Thực hiện việc cấy chuyển nhiều lần cho đến khi độ thuần của dòng vi khuẩn được xác định (Huỳnh Ngọc Thanh Tâm và ctv., 2019)..
- Những dòng vi khuẩn được chấp nhận khi có hình dạng khuẩn lạc trắng đục, hoặc trắng sữa, mô nổi hoặc lài, bìa nguyên hoặc chia thùy.
- Sau khi được phân lập, các dòng vi khuẩn sẽ được kiểm tra hình thái và quan sát độ thuần dưới kính hiển vi bằng cách hòa khuẩn lạc của dòng vi khuẩn cần quan sát vào nước cất vô trùng, đặt trên miếng lam đã khử trùng bằng cồn 96 o , thực hiện quan sát mẫu dưới kính hiển vi (Olympus BX41, Nhật) với vật kính.
- Khi phân lập được dòng thuần từ nguồn mẫu, vi khuẩn lactic được xác định bằng các thí nghiệm sinh hóa được tiến hành như mô tả của Hammes and Hertel (2009): nhuộm Gram, thử nghiệm catalase và oxydase.
- nhuộm bào tử, kiểm tra khả năng sinh lactic acid để xác định vi khuẩn lactic..
- 2.3 Tuyển chọn dòng vi khuẩn lactic có khả năng sinh acid latic cao.
- Nuôi cấy các dòng vi khuẩn lactic trong ống nghiệm chứa 10 mL môi trường MRS trong 48 giờ, ủ lắc ở 37°C.
- Cấy giống vi khuẩn lactic vào môi trường sữa tươi vô trùng đã chuẩn bị (với 10% thể tích môi trường), để yên và ủ 24 giờ ở nhiệt độ 37°C..
- Sau khi thu 2 mL dung dịch vi khuẩn trong môi trường sữa tươi cho vào bình tam giác, nhỏ tiếp 1 – 2 giọt phenolphthalein vào mỗi bình tam giác chứa dung dịch vi khuẩn và tiến hành chuẩn độ bằng cách cho mỗi lần 20 L NaOH 0,1 N đã chuẩn bị, đếm số lần cho vào đến khi mẫu trong bình tam giác chuyển sang màu hồng nhạt và bền màu trong 30 giây.
- 2.4 Định danh dòng vi khuẩn acid lactic có khả năng sinh acid lactic cao bằng kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp đặc điểm hình thái và sinh hóa.
- Dòng vi khuẩn lactic có khả năng lên men acid lactic cao được chọn để định danh đến mức độ loài bằng phương pháp sinh học phân tử, kết hợp với đặc điểm hình thái và thí nghiệm sinh hóa..
- 2.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH, nồng độ muối và mật số vi khuẩn đến quá trình lên men dưa bồn bồn.
- Khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nồng độ muối của dung dịch ban đầu và mật số vi khuẩn đến quá trình lên men dưa bồn bồn, từ đó chọn ra được các thông số thích hợp để quá trình lên men dưa bồn bồn đạt hiệu quả cao.
- Thí nghiệm được bố trí theo mô hình Box Behnken của phần mềm Design Expert 7.0 với ba nhân tố ảnh hưởng đến quá trình lên men dưa bồn:.
- Nhân tố C: mật số vi khuẩn (tế bào/mL), giá trị nhỏ nhất (min) 10 5 và giá trị lớn nhất (max) 10 9 .
- Chuẩn bị vi khuẩn giống: sử dụng dòng vi khuẩn đã được tuyển chọn có khả năng sinh acid lactic cao nhất.
- đoạn 3-4cm, xếp vào bình lên men, 100 g bồn bồn/100 mL dung dịch ngâm) sẽ cho vào môi trường điều được chỉnh lần lượt về nồng độ muối, pH, mật số vi khuẩn dựa theo bố trí thí nghiệm của phần mềm Design Expert 7.0.
- Cho 100 mL dung dịch vào bình lên men, sau đó chủng vi khuẩn với mật số dựa theo bố trí thí nghiệm của Bảng 1, lên men 6 ngày ở nhiệt độ phòng.
- Khi quá trình lên men kết thúc tiến hành phân tích mẫu..
- Chỉ tiêu đánh giá: pH sau lên men.
- 3.1 Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn lactic từ cây bồn bồn.
- Kí hiệu của dòng vi khuẩn được bắt đầu bằng 2 chữ cái viết hoa là tên địa điểm thu mẫu (CM: TP.
- Có 13 dòng trong 24 dòng vi khuẩn được phân lập tại thành phố Cà Mau, chiếm 54,2% tổng số dòng vi khuẩn phân lập được (6 dòng phân lập được từ các bộ phận như lá và bẹ của cây bồn bồn ở phía trên mặt nước, chiếm 46,2% và 7 dòng phân lập được từ các bộ phận như rễ và bẹ của cây bồn bồn ở phía dưới mặt nước, chiếm 53,8%) và 11 dòng vi khuẩn được phân lập tại huyện Ngọc Hiển, chiếm 45,8% (6 dòng vi khuẩn được phân lập từ lá và bẹ của cây bồn bồn ở phía trên mặt nước, chiếm 54,55% và 5 dòng được phân lập từ bẹ và rễ của cây bồn bồn ở phía dưới mặt nước, chiếm 45,45%)..
- Khuẩn lạc của 24 dòng vi khuẩn được nuối cấy trên môi trường MRS sau 48 giờ ủ ở 37 o C có một số đặc điểm giống và khác nhau.
- Trong đó, 10 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng hình tròn, bìa nguyên, nổi mô cao, trắng sữa chiếm 41,7%, 6 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng hình tròn, bìa nguyên, nổi mô, trắng đục, chiếm 25%, 2 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng hình tròn bìa nguyên, mô lài, trắng sữa chiếm 8,3% và 6 dòng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc hình tròn, bìa nguyên, mô lài, trắng đục chiếm 25%..
- Hình 1: Hình dạng khuẩn lạc (a), tế bào (b) và nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn dưới kính hiển vi có độ phóng đại 100X.
- Quan sát các dòng vi khuẩn phân lập được dưới kính hiển vi (Olympus BX41, Nhật) ở vật kính 100X, kết quả cho thấy phần lớn tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây bồn bồn phần lớn có.
- hình que ngắn cụ thể có 7/24 dòng vi khuẩn có tế bào dạng que dài, chiếm 29,2%.
- 3/24 dòng vi khuẩn có tế bào dạng hình cầu, chiếm 12,5% và 14/24 dòng vi khuẩn có tế bào dạng que ngắn, chiếm 58,3%.
- đó, tiến hành một số thử nghiệm đặc trưng bao gồm nhuộm Gram, thử nghiệm catalase và oxidase, đồng thời kiểm tra khả năng sinh acid lactic nhằm xác định đặc tính sinh lý và sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập được.
- Sau khi xác định hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào của các dòng vi khuẩn phận lập được ta tiến hành nhuộm Gram đối với các tế bào còn non (trong khoảng 24 giờ nuôi cấy).
- Kết quả nhuộm Gram cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn đều bắt màu xanh tím (Gram dương).
- Các đặc điểm khuẩn lạc, tế bào và sinh hóa của một số dòng vi khuẩn phân lập được thể hiện ở Hình 1 và Hình 2..
- Hai mươi bốn (24) dòng vi khuẩn Gram dương sẽ được kiểm tra khả năng sinh enzyme catalase và.
- Các dòng vi khuẩn cho kết quả âm tính với catalase được tiến hành thử nghiệm oxydase bằng giấy lọc tẩm thuốc thử.
- Kết quả 21 dòng đều không làm đổi màu giấy thử, cho thấy 100% dòng vi khuẩn không có khả năng sinh enzyme cytochrome oxydase..
- dòng vi khuẩn phân lập được, chọn được 21 dòng vi khuẩn để tiến hành kiểm tra khả năng sinh acid lactic.
- Điều kiện tiên quyết để khẳng định là vi khuẩn lactic là chúng phải có khả năng sinh ra acid lactic.
- Do đó, dịch tăng sinh của 21 dòng vi khuẩn Gram dương, không có khả năng sinh enzyme oxidase và enzyme catalase được thử với Uffelmann để kiểm tra khả năng sinh acid lactic, HCl được chọn làm đối chứng dương.
- Tất cả 21/21 dòng vi khuẩn làm đổi màu dung dịch thuốc thử từ màu tím sang màu vàng, chứng tỏ những dòng này có khả năng sinh acid lactic..
- Theo mô tả hình thái, phân loại sơ bộ về các dòng LAB (Lương Đức Phẩm, 2006), giống vi khuẩn acid lactic là các vi khuẩn Gram dương, chịu acid, không hình thành bào tử, di động hoặc không di động, có tế bào hình que hoặc hình cầu, sinh sản bằng cách nhân đôi, không sinh indole, catalase và oxidase âm tính, phân giải được CaCO 3 .
- giữa đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa, có thể kết luận 21 dòng vi khuẩn phân lập từ cây bồn bồn thuộc vi khuẩn lactic.
- Do đó 21 dòng này được sử dụng cho thí nghiệm tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic cao trong phần tiếp theo..
- 3.2 Tuyển chọn dòng vi khuẩn lactic có khả năng sinh acid latic cao.
- Đánh giá khả năng sinh acid lactic của các dòng vi khuẩn bằng cách nuôi tăng sinh trong môi trường sữa ở nhiệt độ 37°C.
- Nguyên nhân hàm lượng acid tăng theo thời gian do sau 24 giờ số lượng vi khuẩn tăng sinh chưa đủ nên hàm lượng acid lactic sinh ra ít, sau 48 giờ và 72 giờ số lượng vi khuẩn tăng lên nhiều hơn, do đó lượng acid sinh ra cao hơn.
- Yếu tố thời gian nuôi cấy sẽ có ảnh hưởng đến việc tăng số lượng tế bào vi khuẩn.
- Để chuyển hóa được hết nguồn dinh dưỡng thành acid lactic vi khuẩn cần phải có thời gian nhất định và đủ lượng vi khuẩn nhưng khoảng thời gian này quá dài sẽ tác động ngược lại làm giảm số lượng vi khuẩn và lượng acid sinh ra (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 1976).
- Từ kết quả trên, dòng CMT2 được chọn để định danh ở mức độ loài và thực hiện thí nghiệm tối ưu hóa lên men dưa bồn bồn..
- 3.3 Định danh dòng vi khuẩn latic có khả năng sinh acid latic cao bằng kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp đặc điểm hình thái và sinh hóa.
- Thông qua quá trình kiểm tra đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa dòng vi khuẩn CMT2 được định danh bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA..
- sánh mức độ tương đồng của trình tự được giải với trình tự của các dòng vi khuẩn trong ngân hàng gen trên NCBI.
- Kết quả cho thấy trình tự đoạn gen của dòng CMT2 tương đồng với trình tự đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn Lactobacillus plantarum strain JCM 1149 với độ tương đồng là và độ bao phủ 99% (Accession: NR 117813.1).
- có thể kết luận dòng CMT2 là dòng Lactobacillus plantarum đã được đăng ký trên GenBank với mã số MN841920 và được sử dụng trong thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men dưa bồn bồn..
- 3.4 Sự ảnh hưởng của pH, nồng độ muối và mật số vi khuẩn đến quá trình lên men dưa bồn bồn muối chua.
- Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nồng độ muối và mật số vi khuẩn đến quá trình lên men dưa.
- Với kết quả pH và hàm lượng acid actic tạo ra sau khi lên men của 15 nghiệm thức trong Bảng 3 cho ta thấy trong cùng một mức bố trí pH ban đầu, ở những nghiệm thức có hàm lượng acid lactic cao thì pH còn lại sau lên men thấp hơn so với ngiệm thức có hàm lượng acid lactic thấp.
- Nồng độ acid của môi trường lên men ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất hoạt động và quá trình lên men của vi khuẩn..
- Nếu môi trường lên men có nồng độ acid quá cao sẽ ảnh hưởng đến quá trình hoạt động của vi khuẩn, có thể sẽ khiến chúng hoạt động kém dẫn đến sự chuyển hóa của chúng cũng sẽ chậm lại.
- Đồng thời các vi sinh vật có khả năng hoạt động ở môi trường acid cao sẽ phát triển, ngăn cản tác dụng của vi khuẩn gây chua.
- Do đó cần tạo môi trường có độ acid thích hợp cho các vi khuẩn lactic hoạt động..
- Kết quả cho thấy pH của sản phẩm lên men bồn bồn ở tất cả các nghiệm thức đều thấp hơn so với pH ban đầu.
- Mức pH sau lên men dao động từ 3,17 (nghiệm thức 12) đến 3,60 (nghiệm thức 10).
- Hàm lượng acid lactic tổng số sau lên men của các.
- Kết quả này tương đồng với nghiên cứu dưa cải lên men (Nguyễn Văn Mười, 2013) với dịch phối chế ban đầu có nồng độ muối là 4%, sau 6 ngày lên men.
- Kết quả thực nghiệm về giá trị pH của nghiệm thức 15 (pH 5,5, [NaCl] =4% và MSVK 5x10 8 ) sau 6 ngày lên men cho ra giá trị pH 3,19..
- Kết quả này phù hợp với giá trị pH của nghiên cứu lên men dưa cải sau 6 ngày (Nguyễn văn Mười, 2013) khi tất cả các mẫu sau khi kết thúc quá trình lên men đều có giá trị pH dao động trong khoảng 3,1-3,6..
- Bảng 3: Giá trị pH và hàm lượng acid lactic (g/L) của quá trình lên men bằng dòng vi khuẩn CMT2 của 15 nghiệm thức.
- pH TB sau lên men Lượng acid lactic TB (g/L) 2 ngày 4 ngày 6 ngày 2 ngày 4 ngày 6 ngày .
- MSVK: mật số vi khuẩn (tb/mL).
- Để xác định giá trị tối ưu về các nhân tố pH ban đầu, nồng độ muối và mật số vi khuẩn để cho lượng acid lactic tối ưu phải xây dựng phương trình hồi quy dựa trên kết quả lượng acid lactic thu được sau 6 ngày lên men dưa bồn bồn của 15 nghiệm thức được bố trí bằng phần mềm Design Expert 7.0, qua thu thập và phân tích số liệu bằng mềm Design Expert 7.0 với độ tin cậy 95%, đưa ra được phương trình hồi quy là:.
- Acid lactic (g/L.
- và C là mật số vi khuẩn (MSVK) (tế bào/mL)..
- Tuy nhiên, việc lựa chọn điều kiện phù hợp với dòng vi khuẩn Lactobacillus plantarum CMT2 phải căn cứ vào 30 nghiệm thức tối ưu mà phần mềm Design Expert 7.0 đưa ra kết hợp với phương trình hồi quy (1).
- Hình 4: Biểu đồ đường thể hiện sự tương quan giữa pH ban đầu, nồng độ muối đến quá trình lên men dưa bồn bồn (A).
- 4,08% và MSVK= 5,1x10 8 tế bào/mL) cho lượng acid lactic cao nhất sau lên men là 5,71 (g/L) và pH sau lên men là 3,26, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức cho lượng acid lactic thấp nhất 4,95 (g/L) và nghiệm thức 3 (cho kết quả lượng acid lactic là 5,15 (g/L).
- Do đó, các thông số của nghiệm thức 1 với pH 4,87, NaCl 4,08% và MSVK 5,1x10 8 tế bào/mL được chọn là thông số tối ưu cho quá trình lên men dưa bồn bồn..
- Từ cây bồn bồn thu tại tỉnh Cà Mau, 24 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường MRS agar..
- Tuy nhiên, chỉ 21 dòng phù hợp với mô tả về vi khuẩn lactic với các đặc điểm: tế bào hình que, Gram dương, catalase và oxidase âm tính, sinh acid lactic, trong đó dòng CMT2 cho hàm lượng acid cao nhất được tuyển chọn để thực hiện quá trình lên men.
- Kết quả định danh bằng phương pháp 16S rRNA cho thấy dòng CMT2 tương đồng 99% với dòng Lactobacillus plantarum đã được đăng ký trên GenBank với mã số MN841920, đây là dòng vi khuẩn được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu lên men muối chua.
- Nghiên cứu cũng đã xác định được thông số thích hợp cho quá trình lên men dưa bồn bồn là pH 4,87, nồng độ muối 4,08%, mật số vi khuẩn 5,1 x 10 8 tế bào/mL với hàm lượng acid lactic đạt 5,71 g/L sau 6 ngày lên men..
- Định danh và xác định một số đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn lactic trong sản phẩm mắm chua cá sặc.
- Phân lập, tuyển chọn, định danh và ứng dụng dòng vi khuẩn lactic lên men dưa môn ngứa (Colocasia esculenta (L.) Schott).
- Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn Lactobacillus có tiềm năng probiotic từ cây môn ngọt (Colocasia esculenta (L.) SCHOTT).
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bắp cải muối chua.
- Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp amylase và bacteriocin.
- Xác định chế độ tiền xử lý nhiệt nguyên liệu và nồng độ muối ban đầu của dịch lên men đến chất lượng dưa cải