- Application of microorganisms and enzyme protease to improve the quality of traditional fermented soy-sauce. - và nấm men Zygosaccharomyces rouxii 10 2 t bào/ lên men sản p m n ớ t n t u ó n v t m n on tự n ên. - Nước tương là thực phẩm được sử dụng phổ biến ở nước t ở Ch u và ngà càng phổ iến ở nhi u nước tr n thế giới ởi v nước tương giàu chất dinh dưỡng do chứa. - nhi u cid min là gi vị thường được sử dụng trong ăn hàng ngà và trong chế biến thực phẩm Tu nhi n thời gi n gần đ việc sử dụng phương pháp hó giải trong sản xuất nước tương đã tạo r nhi u độc tố nhất là. - 3-MCPD (3-monochloropropane-1,2-diol) g ảnh hưởng đến sức khỏe người ti u dùng Ưu điểm củ phương pháp nà là thời gian sản xuất ngắn mùi vị đã quen với người ti u dùng n n được ư th ch Nhưng nhược điểm là sử dụng cid HCl để thủ ph n g độc hại và ô nhiễm môi trường M t khác phương pháp sản xuất nước tương l n men tru n thống th n toàn cho người ti u dùng nhưng lượng đạm thủ ph n không c o thời gian sản xuất kéo dài và mùi vị chư được người ti u dùng chấp nhận.. - Do đó việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến qu tr nh sản xuất nước tương ằng phương pháp l n men nhằm tạo ra sản phẩm giàu dinh dưỡng n toàn cho người ti u dùng với thời gian sản xuất ngắn không g ảnh hưởng tác hại đến môi trường là vấn đ đ t r cần giải qu ết V vậ việc nghi n cứu cải tiến qu tr nh sản xuất nước tương l n men ằng cách sử dụng vi sinh vật và en me prote se đã được tiến hành. - Th nghiệm được thực hiện tại ph ng Th nghiệm Công nghệ inh học Thực phẩm, Viện Nghi n cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ (ĐHCT). - Phát triển Công nghệ Sinh học ĐHCT. - Chủng giống vi khuẩn Pediococcus halophillus và nấm men Zygosacharomyces rouxii từ Ph ng Th nghiệm Công nghệ inh học Thực phẩm, Viện Nghi n cứu &. - Chế phẩm enzyme protease (mua tại Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Ch Minh).. - 2.2.1 Khảo sát ản ởng của tỉ lệ ủn nấm m và t n ủ koj n ho t t n enzyme protease koji. - Th nghiệm được ố tr ng u nhi n 2 nh n tố: (1) tỉ lệ mốc giống (3 mức độ ào tử/g chất khô) và (2) Thời gian ủ koji (3 mức độ giờ) Th nghiệm l p lại 3 lần n n có 9 (3 3) nghiệm thức và 27 (9 x 3) đơn vị th nghiệm. - Chỉ ti u khảo sát gồm hoạt t nh en me prote se theo phương pháp Anson cải tiến và hàm lượng protein theo phương pháp Br dford (L m Thị Kim Ch u Khảo sát ản ởng ch ph m enzyme. - prote se n khả năn t ủy p ân protein. - Th nghiệm được ố tr ng u nhi n 2 nh n tố: (1) Hàm lượng enzyme bổ sung (6 mức độ:. - và (2) Thời gian thủ ph n (4 mức độ giờ) Th nghiệm l p lại 3 lần n n có 24 (4 6) nghiệm thức và 72 (24 3) đơn vị th nghiệm. - Chỉ ti u khảo sát là hàm lượng đạm min theo phương pháp chuẩn độ formol.. - 2.2.3 Khảo sát ản ởng của chủng gi ng vi khu n Pediococcus halophillus và nấm men Zygosacharomyces rouxii n chất l n và ảm qu n n ớ t n. - Th nghiệm được ố tr ng u nhi n theo h i phương thức bổ sung vi khuẩn và nấm men:. - (1) bổ sung vi khuẩn - nấm men cùng l c vào thời gi n đầu l n men. - (2) ổ sung vi khuẩn trước kiểm tra pH dịch l n men khoảng 5 5 th. - cho nấm men vào H i nh n tố: (1) Mật số tế ào vi khuẩn (3 mức độ tế ào/g dịch l n men). - (2) Mật số tế ào nấm men (3 mức độ tế ào/g m dịch l n men) Th nghiệm l p lại 2 lần tổng cộng có 40 đơn vị th nghiệm.. - Chỉ ti u khảo sát: đánh giá cảm qu n (Hà Du n Tư 2006).. - Thử nghiệm sản xuất nước tương cải tiến từ tu ển chọn nghiệm thức tối ưu củ th nghiệm đồng thời kết hợp so sánh với 2 nghiệm thức đối chứng không ổ sung en me prote se thương mại và nghiệm thức sản xuất nước tương tru n thống.. - Chỉ ti u khảo sát: ph n t ch hàm lượng đạm amin, mật số vi khuẩn và nấm men.. - 2.2.4 Hoàn t ện ó quy trìn sản xuất n ớc t n và k ểm tra chất l ng sản ph m Th nghiệm sản xuất nước tương theo qu tr nh cải tiến với các thông số tối ưu từ các th nghiệm đã thực hiện.. - các chỉ ti u lý hó vi sinh (gởi m u ph n t ch ở Trung t m kiểm nghiệm).. - 3 KẾT QUẢ VÀ T ẢO LUẬN. - 3.1 Ảnh hƣởng của tỉ lệ hủng nấm mố v thời gi n ủ koji ến hoạt tính ủa enzyme protease koji. - Kết quả th nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nấm mốc và thời gian ủ ảnh hưởng đến hoạt t nh prote se koji được tr nh à ở Bảng 1. - Kết quả Bảng 1 cho thấy hoạt t nh prote se koji tại thời điểm 52 giờ với lượng mốc giống chủng vào là 10 6 ào tử/gck đạt giá trị cao nhất ở nghiệm thức 6 (5,13 U/g m u). - Với cùng lượng mốc giống chủng (10 6 ào tử/gck) nếu tiếp tục kéo dài thời gian ủ đến 68 giờ (nghiệm thức 9), hoạt t nh prote se đã giảm uống mức 4,73 U/g m u Kết quả khảo sát cho thấ môi trường khối koji l c nà có hệ khuẩn t phát triển chậm và sự h nh thành ào tử diễn ra mạnh làm khối koji chuyển từ vàng nh s ng màu nh đậm do đó đã làm giảm đi hoạt t nh enzyme protease.. - Tổ hợp thời gian (giờ) v tỉ lệ mốc gố (b o tử/gck). - Hoạt tính prote se koji (U/g mẫu). - Tu nhi n với tỉ lệ mốc giống 10 4 và 10 5 ào tử/gck th thời gian ủ từ 42 - 68 giờ hoạt t nh prote se tiếp tục tăng do khi ủ ào tử nấm mốc nảy mầm và phát triển hệ khuẩn ty chậm hơn so với nghiệm thức được chủng tỉ lệ 10 6 ào tử/gck Trong cùng một thời gian ủ là 52 giờ nhưng với tỉ lệ mốc giống chủng vào ở 3 mức độ ào tử/gck sẽ cho kết quả khác iệt có ý nghĩ thống k 5% với hoạt. - t nh prote se lần lượt là (4 09 U/g m u) ở nghiệm thức 4, (4,38 U/g m u) ở nghiệm thức 5, (5,13 U/g m u) ở nghiệm thức 6, cho thấy tỉ lệ mốc giống chủng vào có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt t nh prote se koji Đồng thời ở nghiệm thức 6 với thời gian ủ koji là 52 giờ và tỉ lệ mốc giống 10 6 ào tử/gck cho hoạt t nh prote se đ c hiệu cao nhất 21,15 (U/g m u) Kết quả nghi n cứu phù hợp với công ố của. - Qu đó cho thấy tỉ lệ mốc giống và thời gian ủ koji rất ảnh hưởng đến hoạt t nh protease củ koji V vậ nghiệm thức 6 với tỉ lệ nấm mốc là 10 6 ào tử/gck cùng với thời gian ủ là 52 giờ được chọn để tiến hành các th nghiệm sau.. - 3.2 Ảnh hƣởng chế phẩm en me prote se bổ sung ến khả năng thủ phân protein. - Xá nh ho t t n ủ p m enzyme Kết quả đo hoạt t nh chế phẩm enzyme ở. - Bảng 2 được sử dụng để t nh toán và ph n t ch các thông số.. - Bảng 2: Hoạt tính ủ hế phẩm en me protease. - Chỉ số Chế phẩm. - enzyme protease. - Hoạt t nh en me (U/g) 12,20. - Hàm lượng protein (mg/g) 352,80 Hoạt t nh đ c hiệu (U/g) 34,58 K t quả là s liệu trun bìn ủa 3 l n lặp l i. - Trước khi tiến hành gi i đoạn l n men trong nước muối gi i đoạn thủy ph n koji được tiến hành ở 50 o C có ổ sung chế phẩm enzyme protease. - Chế phẩm en me được bổ sung ở 5 mức độ: 1. - Kết quả ác định hiệu suất thủ ph n đạm amin khi bổ sung chế phẩm enzyme protease được tr nh à ở Bảng 3.. - Bảng 3: m lƣợng ạm min v hiệu suất thủ phân. - Nghiệm th c Tổ hợp en me v thời gian N amin (mgN/gck) Hiệu suất. - Kết quả Bảng 3 cho thấ hàm lượng đạm amin ở các nghiệm thức có ổ sung enzyme protease cho kết quả khác iệt có ý nghĩ thống k 5% so với m u đối chứng không ổ sung enzyme protease. - Nghiệm thức 15 với hàm lượng enzyme protease bổ sung 2% sau 36 giờ thủ ph n đạt hàm lượng đạm min c o nhất (20 04 mgN/gck) c o hơn rất nhi u so với m u đối chứng không ổ sung en me (ở nghiệm thức 1 (11 53 mgN/gck) 2 (16 41 mgN/gck) và 3 (17 78 mgN/gck) tu nhi n nó không khác iệt ý nghĩ với nghiệm thức có ổ sung cùng tỉ lệ en me 2% (nghiệm thức 14 (19 95 mgN/gck) và 16 (19 91 mgN/gck)) Trong các nghiệm thức có ổ sung en me (1;. - th các nghiệm thức có cùng tỉ lệ ổ sung en me 2% (ở các mức thời gi n 24 36 48 giờ) cho kết quả đạm min c o nhất và khác iệt có ý nghĩ với với các nghiệm thức c n lại đ c iệt là c o hơn cả các nghiệm thức có ổ sung en me với tỉ lệ c o hơn (2 5 và 3%) Theo L Ngọc T (2000) khi ổ sung enzyme với nồng độ quá lớn th tốc độ phản ứng tăng chậm do có sự cạnh tranh gi a en me và cơ chất trong việc gắn vào vị tr trung t m hoạt động của enzyme.. - Bảng 3 c ng cho thấ hiệu suất thủ ph n ở các nghiệm thức có ổ sung enzyme protease cho kết quả khác iệt có ý nghĩ thống k 5%. - so với m u đối chứng không ổ sung en me prote se Kết quả c ng tương tự như hàm lượng đạm min hiệu suất thủ ph n ở các nghiệm thức có ổ sung en me prote se 2%. - Kết quả Bảng 3 cho thấ có sự khác iệt ý nghĩ củ hàm lượng đạm min c ng như hiệu suất thủ ph n đạm min đối với tỉ lệ en me protease bổ sung và thời gian trong suốt quá tr nh thủ ph n koji Theo teinkr us (2004) chế phẩm en me prote se là một. - endoprotease cắt nội ph n tử cho ra nhi u đoạn peptide ngắn Đồng thời có sự kết hợp với các e oprote se trong prote se koji như c r o peptid se và minopeptid se sẽ tiếp tục ph n cắt cho r các cid min. - Từ kết quả th nghiệm (Bảng 3) chỉ r các nghiệm thức với tỉ lệ ổ sung en me prote se 2% (ở các mức thời gi n 24 36 48 giờ) cho kết quả đạm min và hiệu suất thủ ph n c o nhất và khác iệt có ý nghĩ với các nghiệm thức đối chứng và các nghiệm thức với các tỉ lệ ổ sung en yme 1. - 3% Trong các nghiệm thức có tỉ lệ ổ sung en me prote se 2%, nghiệm thức 15 (36 giờ thủ ph n) cho hàm lượng đạm min và hiệu suất thủ ph n c o nhất (20 04 mgN/gck. - nhưng không khác iệt có ý nghĩ với nghiệm thức nghiệm thức 14 (24 giờ thủ ph n) (19 95 mgN/gck. - 44 53%) và nghiệm thức 16 (48 giờ thủ ph n) (19 91 mgN/gck. - Từ đó có thể đi đến kết luận nghiệm thức 14 ổ sung 2% en me prote se thời gi n thủ ph n 24 giờ là nghiệm thức tốt nhất (thời gi n thủ ph n ngắn nhất) sẽ được chọn cho các th nghiệm tiếp theo.. - 3.3 Ảnh hƣởng chủng giống vi khuẩn Pediococcus halophillus v nấm men Zygosachromyces rouxii ến chất lƣợng v hƣơng v nƣớ tƣơng. - Ng s u gi i đoạn thủ ph n ởi en me prote se ổ sung hoàn tất dịch thủ ph n sẽ được chuyển s ng gi i đoạn l n men nước muối. - Ở gi i đoạn nà có ổ sung chủng vi khuẩn, nấm men chịu m n để tạo màu sắc và hương vị tự nhi n củ nước tương l n men Sản phẩm thu được củ th nghiệm bổ sung vi khuẩn và nấm men sẽ được đánh giá cảm quan v màu sắc và mùi vị (so với m u đối chứng) nhằm mục đ ch chọn ra nghiệm thức hay sản phẩm tốt nhất để tiến hành ố tr cho th nghiệm sau.. - Kết quả đánh giá cảm qu n được tr nh à ở H nh 1.. - nh 1: nh gi ảm qu n sản phẩm nƣớ tƣơng theo nghiệm th kh nh u. - *P n t ứ 1: bổ sung vi khu n nấm men ùn l m n ệm t ứ : 0: ẫu i chứn k ôn bổ sung vi khu n, nấm men, I1: bổ sung 10 2 tbvk/ và 10 2 tbmn/g, I2: 10 2 tbvk/ và 10 4 tbmn/g, I3: 10 2 tbvk/ và 10 6 tbmn/g, I4:10 4 tbvk/g và 10 2 tbmn/g, I5: 10 4 tbvk/ và 10 4 tbmn/g, I6: 10 4 tbvk/ và 10 6 tbmn/g, I7: 10 6 tbvk/ và 10 2 tbmn/g, I8: 10 6 tbvk/ và 10 4 tbmn/g, I9: 10 6 tbvk/ và 10 6 tbmn/ P n t ứ 2: bổ sung vi khu n tr ớ s u ó k ểm tra pH khoảng 5,5 r i bổ sung nấm men m n ệm t ứ : 0: ẫu i chứn k ôn bổ sung vi khu n, nấm men, II1: 10 2 tbvk/ tr ớ s u ó bổ sung 10 2 tbmn/g, II2: 10 2 tbvk/ tr ớc, sau 10 4 tbmn/g. - II3: 10 2 tbvk/ tr ớc, sau 10 6 tbmn/g. - II4: 10 4 tbvk/ tr ớc, sau 10 2 tbmn/g. - II5: 10 4 tbvk/ tr ớc, sau 10 4 tbmn/g. - II6: 10 4 tbvk/ tr ớc, sau 10 6 tbmn/g. - II7: 10 6 tbvk/ tr ớc, sau 10 2 tbmn/g. - II8: 10 6 tbvk/ tr ớc, sau 10 4 tbmn/g. - II9: 10 6 tbvk/ tr ớc, sau 10 6 tbmn/g. - Kết quả đánh giá cảm qu n (H nh 1) cho thấy nghiệm thức I4 (bổ sung vi khuẩn với mật số 10 4 và nấm men 10 2 tế ào/g dịch l n men) đạt điểm cao nhất và khác iệt có ý nghĩ 5%. - so với các nghiệm thức c n lại. - (2003) việc bổ sung th m các vi khuẩn như Pediococcus halophillus và nấm men Zygosaccharomyces rouxii có v i tr qu n trọng trong việc tạo hương vị đ c trưng cho sản phẩm nước tương l n men Các vi khuẩn chịu m n biến đổi đường thành các cid khác nh u như cid cetic và cid l ctic Các cid nà gi p tạo vị chua nhẹ cho nước tương đồng thời gi p cho việc bảo quản sản phẩm C n nấm men sử dụng đường để tạo r các lcohol như là eth l prop l pent l…và các cid h u cơ nhất là cid succinic Các lcohol gi p tạo mùi c n cid gi p tạo vị cho nước tương Đồng thời c ng ả r các phản ứng tương tác gi các chất tạo r do l n men như: acid h u cơ phản ứng với các lcohol với acid acetic, với acid éo tự do để tạo r các ester thơm;. - acid amin phản ứng với đường để tạo r các sắc tố n u h đỏ các sắc tố nà s u đó ph trộn với các sắc tố loại fl vone có sẵn trong đậu nành và gi p tạo màu củ nước tương.. - Từ kết quả tr n nghiệm thức I4 được chọn để tiến hành sản xuất nước tương cải tiến, đồng thời so sánh với nghiệm thức đối chứng (một không ổ sung chế phẩm en me và một có ổ sung chế phẩm en me) và nghiệm thức sản xuất nước tương tru n thống.. - Kết quả ph n t ch hàm lượng đạm amin ở Bảng 4 cho thấ hàm lượng đạm min t nh theo thời gi n l n men đạt giá trị cao nhất (9,36 gN/L) ở nghiệm thức 3 (có ổ sung en me và vi khuẩn nấm men) vào ngà thứ 9 và c o hơn nhi u so với các nghiệm thức đối chứng ở cùng thời điểm: (8,3 gN/L) nghiệm thức 1 (không en me) (8 5 gN/L) ở nghiệm thức 2 (có en me) và (7 8 gN/L) ở nghiệm thức 4 (truy n thống) có hàm lượng đạm amin thấp nhất.. - Bảng 4: m lƣợng ạm min theo nghiệm th trong qu tr nh l n men Thời gian. - u khi đạt giá trị c o nhất ở 9 ngà l n men lượng đạm min ắt đầu giảm dần có thể là do quá tr nh l n men tiếp tục diễn r và có sự biến đổi đạm min thành các chất khác trong suốt quá tr nh nà hơn n một phần là do các nhóm vi sinh vật trong khối l n men sử dụng đạm min cho hoạt động tr o đổi chất củ ch ng V vậ giá trị đạm min vào ngà thứ 15 ở các nghiệm thức như s u: nghiệm thức ổ sung en me và vi khuẩn nấm men-NT3 có hàm lượng đạm amin cao nhất (8,46 gN/L) hàm lượng đạm amin thấp nhất là ở nghiệm thức tru n thống-NT4 (6,93 gN/L), đồng thời c ng cho thấy sự khác iệt rõ ràng v hàm lượng đạm min đối với nghiệm thức có ổ sung en me-NT2 (7 76 gN/L) c o hơn so với nghiệm thức không ổ sung enzyme- NT1 (7,37 gN/L).. - M c khác nếu ét v giá trị trung nh hàm lượng đạm min theo các nghiệm thức th ở NT3 (có en me và V V) khác iệt có ý nghĩ thống k 5% so với các nghiệm thức đối chứng (NT1. - Kết quả Bảng 4 cho thấy NT3 có giá trị trung nh đạm amin cao nhất (7 76 gN/L) và c o hơn nhi u so với NT4 (6 36 gN/L) NT1 (6 99 gN/L) và NT2 (7 32 gN/L) Đi u đó chỉ r được hiệu quả của việc. - bổ sung en me trong gi i đoạn thủ ph n ở NT2 và NT3 cho hàm lượng đạm amin cao hơn so với NT1 và NT4 (không có ổ sung enzyme).. - V vậ để tạo ra sản phẩm nước tương l n men có hàm lượng đạm min c o n n sử dụng nghiệm thức 3 có ổ sung en me và vi sinh vật trong quá tr nh sản xuất.. - 3.4 o n thiện h qu tr nh sản xuất nƣớc tƣơng l n men v kiểm tra chất lƣợng sản phẩm. - Từ các thông số tối ưu củ các th nghiệm Qu tr nh sản uất nước tương cải tiến với 4 công đoạn như s u: (1) tạo koji. - (2) thủ ph n koji. - Kết quả so sánh ở Bảng 5 cho thấy sản phẩm nước tương theo qu tr nh cải tiến đạt ti u chuẩn qu định của Bộ Y Tế. - Sản phẩm đạt hàm lượng đạm tổng (15 4 gN/L) c o hơn so với các sản phẩm thị trường (4,0 -11 gN/L) và có giá trị dinh dưỡng cao với hàm lượng đạm min đạt 8 4 (gN/L) Đồng thời sản phẩm nước tương không có sự hiện diện của 3- MCPD n n n toàn cho người ti u dùng. - Bảng 5: So s nh hỉ ti u hất lƣợng chủ yếu của sản phẩm qu tr nh ải tiến v sản phẩm th trƣờng. - SP qu tr nh cải tiến. - Trong qu tr nh sản uất nước tương việc chủng giống thuần Aspergillus oryzae với mật số 10 6 ào tử/g chất khô đã r t ngắn thời gian ủ koji xuống c n 52 giờ so với quá tr nh ủ truy n thống khoảng 4 - 5 ngà Chủng giống thuần kết hợp bổ sung 2% chế phẩm enzyme thương mại vào công đoạn thủ ph n koji ở 50 o C, 24 giờ trước khi bổ sung muối cho hiệu suất thủ ph n đạm amin cao (44,53%).. - Bổ sung vi khuẩn Pediococcus halophillus với mật số 10 4 tế ào/g và nấm men Zygosaccharomyces rouxii 10 2 tế ào/g dịch trong gi i đoạn l n men trong nước muối cho sản phẩm nước tuơng có hương vị thơm ngon tự nhi n ản phẩm nước tương l n men có chất lượng c o đạt ti u chuẩn vệ sinh n toàn thực phẩm và đăc iệt là không có 3-MCPD.. - Viện Nghi n cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ