- SẢN XUẤT MEN RƯỢU TỪ SACCHAROMYCES CEREVISIAE VÀ ENZYME AMYLASE TRONG MẦM LÚA. - Trong nghiên cứu này mật số nấm men và nấm mốc của năm loại men rượu thị trường đã được xác định (nấm men log cfu/g và nấm mốc log cfu/g), và tổng cộng có 26 dòng nấm men được phân lập thuần chủng. - Năm dòng phân lập có khả năng lên men mạnh đã được sơ tuyển và tiến hành so sánh với dòng men Saccharomyces cerevisiae. - Đề tài cũng đã khảo sát được sự biến đổi hàm lượng enzyme amylase trong mầm lúa qua 7 ngày ủ, mầm lúa có hoạt tính enzyme cao nhất sau 4 ngày ủ (9,0 U/g). - Đề tài bước đầu đã thử nghiệm sản xuất được bột men rượu bằng phương pháp phối trộn bột men thuần Saccharomyces cerevisiae và bột mầm lúa ở 3 tỷ lệ khác nhau (1:3, 1:4 và 1:5).. - Đường hóa và lên men rượu là hai giai đoạn chủ yếu trong qui trình sản xuất rượu lên men. - Giai đoạn đường hoá là một quá trình biến đổi hóa học, chuyển tinh bột. - thành đường lên men nhờ hoạt động của các enzyme thuỷ phân tinh bột amylase sẵn có trong nguyên liệu hay sản sinh từ vi sinh vật. - Giai đoạn lên men rượu là quá trình lên men yếm khí của nấm men, chuyển hóa đường thành rượu etylic và CO 2 (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005). - Chúng sẽ được hình thành sau ngày thứ 2 của quá trình ươm mầm và đạt cực đại sau 8 ngày với độ hoạt hóa tăng lên khoảng 150 - 200 lần (Bùi Ái, 2005). - Các enzyme này có thể được phối trộn vào thành phần men rượu thay thế một phần vai trò của vi sinh vật trong bánh men, rút ngắn thời gian sản xuất.. - Hệ vi sinh vật trong men rượu giữ vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất rượu, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng sản phẩm. - Nấm mốc thực hiện quá trình đường hoá và nấm men thực hiện quá trình lên men rượu, là hai nhóm vi sinh vật chủ yếu có trong men làm rượu. - Một số nấm men chính gồm có Saccharomyces cerevisiae, Hansenula spp., Endomycopsis spp.. - Kết quả nghiên cứu sản xuất men làm rượu với dạng hạt gồm tổ hợp nấm mốc Amylomyces rouxii và nấm men Saccharomyces cerevisiae được xác định có hoạt tính cao (Dung et al., 2005) và bước đầu thử nghiệm cho thấy khả năng ứng dụng trong quá trình lên men rượu từ một số loại nông sản (gạo, nếp) khác nhau (Dung &. - Ngoài ra, gần đây hướng ứng dụng enzyme amylase từ mầm lúa để thay thế cho nguồn enzyme từ nấm mốc cũng là một vấn đề cần được khảo sát với mục đích góp phần rút ngắn thời gian sản xuất rượu và vẫn đảm bảo chất lượng, an toàn cho người tiêu dùng.. - Mục tiêu của đề tài là khảo sát thành phần nguồn bánh men thị trường, tuyển chọn dòng nấm men có khả năng lên men ethanol tốt và bước đầu nghiên cứu sản xuất bột men làm rượu gồm nấm men thuần và enzyme amylase từ mầm lúa.. - Nguyên liệu: lúa, gạo, men rượu thị trường và dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae đã được phân lập, thử nghiệm và tuyển chọn trong nghiên cứu của Dung et al. - Hóa chất: dùng trong phân tích hoạt tính enzyme amylase và nuôi cấy nấm men.. - 2.2.1 Thu thập men rượu thị trường và xác định mật số nấm men và nấm mốc Mẫu men rượu thị trường được thu thập gồm có: men rượu Hải Anh Quan (HAQ), Quang Minh (QM), Hoàng Anh (HA), Dung-Đức Thành (DĐT) và Linh Chi (LC).. - Mật số nấm men và nấm mốc trong mẫu men rượu được thực hiện và xác định trên môi trường RBC Agar sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ ủ ở 30 o C.. - 2.2.2 Phân lập và đánh giá sơ bộ hình thái các dòng nấm men. - Các khuẩn lạc nấm men trên đĩa môi trường RBC Agar được cấy chuyền nhiều lần trên môi trường PGA, ủ ở 30 o C cho đến khi thu được khuẩn lạc thuần nhất. - Độ ròng và hình thái nấm men được xác định bằng cách quan sát dưới kính hiển vi quang học. - 2.2.3 So sánh và tuyển chọn nấm men có khả năng lên men ethanol mạnh. - Các dòng thuần được kiểm tra khả năng lên men đường glucose dựa trên lượng khí CO 2 sinh ra trong quá trình lên men rượu. - Sau 24 giờ phát triển sinh khối trong môi trường PGY ở 30 o C, 1ml dung dịch nấm men được chủng vào chai Durham chứa 9ml dung dịch glucose 2% (đã được khử trùng ở 115 o C trong 10 phút), lắc đều cho dịch đường tràn đầy vào ống thuỷ tinh úp ngược nằm bên trong chai Durham, ủ ở 30 o C. - Chọn 5 dòng nấm men tốt nhất từ 5 loại bánh men để so sánh khả năng lên men với dòng nấm men S.. - Dịch sinh khối nấm men (1ml) được chủng vào 100ml dung dịch glucose 20%, ủ ở 30 o C và tiến hành theo dõi lượng bọt khí sinh ra tại các thời điểm tương tự như trên và đo độ cồn sau 48 giờ lên men. - 2.2.4 Xác định hoạt tính enzyme amylase trong mầm lúa và bánh men. - Hoạt tính enzyme amylase trong mầm lúa được khảo sát tại các thời điểm lên mầm khác nhau để lựa chọn thời gian ủ mầm cho lượng enzyme nhiều nhất. - Mầm lúa được sấy khô ở 40 o C trong 24 giờ. - Xác định hoạt tính enzyme trong mầm lúa và bánh men bằng phương pháp Nelson (Nelson, 1994). - 2.2.5 Sản xuất men rượu gồm nấm men và enzyme amylase. - Men rượu được phối trộn từ bột nấm men thuần (sản xuất từ dòng nấm men đã tuyển chọn) và bột lúa chứa hệ enzyme amylase. - Bột men thuần được phối trộn với bột mầm lúa ở các tỷ lệ khác nhau tạo thành sản phẩm bột men. - Bột men được trữ trong túi nhựa hàn kín miệng và bảo quản ở nhiệt độ phòng.. - Bột men thuần được sản xuất như sau: chủng 100ml dịch sinh khối nấm men (ủ 16 giờ trong môi trường PG) vào 100g bột gạo (sấy ở 100 o C và để nguội), tạo ẩm đến khoảng 40% bằng dung dịch muối khoáng (MgSO 4 0,05%, (NH 4 ) 2 SO 4 0,2%,. - Hỗn hợp được cho vào bọc, xom lỗ, ủ ở 30 o C trong 24 giờ, thu hoạch và sấy khô ở 42 o C, xay nhỏ tạo thành bột men thuần. - Mầm lúa được sấy khô ở 40 - 42 o C trong 24 giờ và nghiền thành bột.. - 2.2.6 Khảo sát khả năng lên men của bột men thành phẩm. - Bột men thành phẩm được dùng làm men giống cho quá trình lên men rượu gạo.. - Hai nhân tố bao gồm tỷ lệ bột men thuần và bột mầm lúa (bố trí 3 mức độ khác nhau, tuỳ theo kết quả so sánh hoạt tính enzyme trong thí nghiệm 2.2.4) và hình thức lên men (bố trí 2 mức độ khác nhau: chan nước ngay sau khi trộn men, lên men 7 ngày. - và chan nước sau khi trộn men 1 ngày, lên men 6 ngày). - để lên men trong 7 ngày (nghiệm thức 1) hoặc 6 ngày (nghiệm thức 2. - Chỉ tiêu đánh giá gồm có lượng khí CO 2 được sinh ra trong quá trình lên men, độ cồn thu được sau chưng cất và mùi vị sản phẩm rượu thành phẩm.. - 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN. - 3.1 Xác định mật số nấm men, nấm mốc và phân lập nấm men. - Mật số nấm men và nấm mốc hiện diện trong 5 loại men rượu thị trường được trình bày trong bảng 1. - Kết quả cho thấy mật số nấm mốc và nấm men trong các loại men rượu thị trường khá cao, lần lượt là và log cfu/g.. - Bảng 1: Mật số nấm mốc và nấm men trong 5 loại men rượu thị trường. - Đối với bánh men có bổ sung enzyme, nhà sản xuất công bố thành phần bột men chỉ gồm nấm men và enzyme, song kết quả phân tích cho thấy trong những loại men này còn có bào tử nấm mốc với mật số tương đối cao, chứng tỏ nấm mốc có vai trò quan trọng không thể thay thế trong quá trình lên men rượu.. - Các khuẩn lạc nấm men được cấy chuyền nhiều lần trên môi trường PGA cho đến khi đạt được độ thuần nhất. - Các dòng nấm men có nhiều hình dạng khác nhau: hình cầu, elip và ovan. - Hình dạng tiêu biểu của một dòng nấm men phân lập được trình bày trong hình 1.. - Hình 1: Hình dạng tế bào nấm men đã được phân lập (vật kính E40). - 3.2 So sánh khả năng lên men và tuyển chọn dòng nấm men có hoạt tính cao Khả năng lên men ethanol của 26 dòng nấm men được khảo sát bằng phương pháp đo chiều cao cột khí CO 2 (cm) sinh ra trong chuông Durham. - Chiều cao tối đa của cột khí trong chai Durham là 4,2cm, và trên nguyên tắc là trong quá trình lên men rượu cột khí sinh ra càng cao thì khả năng lên men ethanol càng mạnh. - Kết quả cho thấy sau 6 giờ ủ lên men, có 10 dòng phân lập thể hiện khả năng lên men sớm và mạnh với trung bình chiều cao cột khí từ 2,2 - 2,58cm. - Hầu hết các dòng nấm men đều cho thấy kết quả chiều cao cột khí trong chuông Durham không khác biệt giữa mốc thời gian ủ 12 giờ và 14 giờ. - Kết quả sau 14 giờ kết thúc quá trình lên men, các dòng nấm men có cột khí cao nhất ở mỗi loại bánh men được tuyển chọn cho thí nghiệm kế tiếp gồm có: Y2LC (3,73cm), Y2DĐT (3,58cm), Y3HA (3,25cm), Y1QM (3,23cm) và Y2HAQ (3,17cm). - Năm dòng nấm men sơ tuyển này được sử dụng để so sánh khả năng lên men với dòng men S. - Kết quả đo chiều cao cột khí và đếm số lượng bọt khí sinh ra trong quá trình lên men cho thấy sáu dòng nấm men thể hiện khả năng lên men khá mạnh và cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa giữa các dòng men. - Quá trình lên men có dấu hiệu giảm mạnh ở thời gian sau 24 giờ lên men. - Tuy nhiên, Bảng 2 cho thấy kết quả phân tích độ cồn sinh ra thu được (ở 20 o C) sau 48 giờ lên men có khác biệt ý nghĩa ở độ tin cậy 95% giữa một số dòng men. - nghiên cứu sản xuất và khảo sát khả năng lên men của bột men gồm nấm men và enzyme amylase.. - Bảng 2: Kết quả ethanol thu được sau 48 giờ lên men của sáu dòng men. - 3.3 Xác định hoạt tính enzyme amylase trong quá trình lên mầm lúa. - Hoạt tính enzyme amylase trong mầm lúa được khảo sát qua các ngày ủ lên mầm nhằm xác định thời gian ủ mầm lúa đạt hoạt tính enzyme cao nhất. - Kết quả ở hình 2 cho thấy hoạt tính enzyme trong mầm lúa tăng dần trong 4 ngày ủ đầu tiên và đạt giá trị cao nhất 9,0 U/g vào ngày thứ 4, sau đó giảm dần.. - Như vậy, mầm lúa ở 4 ngày ủ có hoạt tính enzyme cao nhất, khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%, nên được chọn để tiến hành thí nghiệm sản xuất bột mầm lúa. - Tuy nhiên, so với hàm lượng enzyme có trong 5g cơ chất khô của bột men thị trường (21,96 U/g) thì lượng enzyme trong mầm lúa ở ngày cao nhất còn thấp hơn 2,44 lần. - Vì thế, tỉ lệ pha trộn nấm men và mầm lúa trong thí nghiệm sản xuất bột men được xác định là 1:3, 1:4 và 1:5.. - Hình 2: H oạt tính enzyme amylase trong quá trình ủ lên mầm. - Hoạt tính enzyme (U/g. - 3.4 Khả năng lên men của bột men rượu gồm nấm men và enzyme amylase Khả năng lên men của bột men rượu gồm tổ hợp nấm men và enzyme amylase có trong bột mầm lúa được khảo sát ở 3 tỷ lệ phối trộn tương ứng là 1:3. - 1:4 và 1:5 với 2 phương pháp lên men khác nhau. - Kết quả đếm bọt khí sinh ra trong quá trình lên men rượu được trình bày trong hình 3.. - Hình 3: Lượng bọt khí CO 2 sinh ra trong quá trình lên men. - Kết quả cho thấy ở phương pháp lên men chan nước trực tiếp sau khi trộn men không có sự chênh lệch về số lượng bọt khí sinh ra có ý nghĩa giữa 3 tỷ lệ phối trộn. - Lượng bọt khí sinh ra nhiều ở 12 và 24 giờ cho thấy enzyme phát huy tác dụng tốt và nấm men cũng thích nghi với phương thức này. - Các nghiệm thức sử dụng phương pháp lên men chan nước sau khi trộn và ủ hiếu khí 1 ngày cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về lượng bọt khí sinh ra giữa các tỷ lệ bột men và mầm lúa, trong đó tỷ lệ 1:4 cho kết quả bọt khí tương đối cao sau 12 giờ chan nước. - Quá trình kết thúc lên men của 2 nghiệm thức xảy ra cùng thời gian (sau 7 ngày ủ).. - Bảng 3 thể hiện kết quả phân tích độ cồn sinh ra thu được (ở 20 o C) sau quá trình lên men rượu.. - Bảng 3: Kết quả ethanol sau quá trình lên men của các nghiệm thức Tỷ lệ bột. - men : mầm lúa. - Độ rượu ở 20 o C sau lên men (%w/v) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 1 : 3 B a. - A1: Bột men : mầm lúa = 1:3 A2: Bột men : mầm lúa = 1:4 A3: Bột men : mầm lúa = 1:5 B1: Chan nước ngay sau khi trộn men B2: Chan nước sau khi trộn men 1 ngày. - Kết quả cho thấy độ rượu giữa 2 phương thức lên men ở các tỷ lệ phối trộn bột men và mầm lúa không có khác biệt ý nghĩa. - Ở nghiệm thức B1 sau 7 ngày lên men sản phẩm có mùi khó chịu và chua, chứng tỏ đã xảy ra quá trình lên men lactic sau quá trình lên men rượu, vì vậy có khả năng một lượng rượu đã thất thoát trong quá trình lên men chua này. - Lượng dịch lên men trong sản phẩm nhiều và lượng cơ chất cũng bị phân hủy tương đối. - Sản phẩm ở nghiệm thức B2 sau 6 ngày chan nước có hương cơm rượu đặc trưng, nhưng lượng cơ chất chưa được sử dụng hết và lượng dịch lên men sinh ra không nhiều. - Điều này chứng tỏ nấm men vẫn hoạt động nhưng lượng enzyme có thể chưa được thể hiện tác dụng tối đa trong quá trình đường hóa để tạo ra lượng đường khử nhiều cung cấp cho quá trình rượu hóa dưới hoạt tính của nấm men.. - Khả năng lên men rượu của 26 dòng phân lập từ 5 loại men thị trường được xác định và so sánh với khả năng lên men của nấm men S. - Bột men rượu gồm tổ hợp nấm men S. - cersvisiae và enzyme amylase đã được sản xuất bằng cách phối trộn bột mầm lúa và bột men thuần ở 3 tỷ lệ khác nhau (1:3, 1:4 và 1:5).. - Phương thức lên men thích hợp hơn được thể hiện khi chan nước 1 ngày sau chủng giống vả ủ. - Kết quả đề tài này cho thấy nguồn enzyme amylase có khả năng được sử dụng thay thế nguồn giống nấm mốc trong quá trình đường hóa. - Tuy nhiên, khả năng lên men rượu của bột men ở 3 tỷ lệ này không có khác biệt ý nghĩa và nồng độ cồn sinh ra chưa cao, vì thế cần được tiếp tục nghiên cứu ở các tỷ lệ phối trộn khác nhau, cũng như nên thử nghiệm so sánh với bột men rượu gồm tổ hợp nấm mốc và nấm men trong quá trình lên men rượu.. - Công nghệ lên men ứng dụng trong Công nghệ thực phẩm, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP